用于生物分析应用的红外光谱技术与基底之间的可比性

《RSC Advances》：Comparability across infrared spectroscopy techniques and substrates for bioanalytical applicationsOpen Access

　　

量子级联激光器（QCL）的发展为生物分析应用中的红外（IR）光谱带来了新的可能性，提供了高度增强的分辨率、灵敏度、速度和多模态能力。基于QCL的IR技术，包括激光直接红外（LDIR）和光学光热红外（O-PTIR）方法，支持了这一进展。尽管具有巨大优势，但这些IR技术与已建立的傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术之间的可比性仍然是一个悬而未决的问题。在本研究中，研究人员系统评估并比较了O-PTIR、LDIR和FTIR光谱，使用了六种代表性生物相关样品（ATP、脑脂提取物、胆固醇、糖原、溶菌酶和尿素）以及三种常用基底（CaF₂、硅和MirrIR）。测量通常在单点模式下进行，脑脂和尿素还额外在映射模式下测量，以研究样品异质性的影响。在此基础上，研究人员检查了本研究中变异性的三个来源：样品异质性、IR技术和基底。变异性从谱带强度、谱带位置、谱带宽度以及基于Pearson相关系数的光谱相似性角度进行了表征。总体而言，测量结果显示出技术和基底之间的明显差异。LDIR测量与FTIR和O-PTIR测量有很大不同，而CaF₂表现出比MirrIR（Kevley）和硅更好的稳定性。更重要的是，研究人员发现基底在谱带位置中起作用，而不同IR技术之间的变异性没有显示出清晰的模式。通过这项研究，研究人员期望引起对IR测量中跨IR技术和基底不可避免的光谱变异性的关注，尤其是在多中心研究中应仔细考虑这一点。

**红外光谱技术与基底可比性的系统研究：解读《RSC Advances》论文**

**研究背景与问题**

红外（IR）光谱作为一种非侵入、无标记的分析工具，在生物医学诊断、法医学、制药和环境科学等领域得到广泛应用。传统上，傅里叶变换红外（FTIR）光谱凭借其宽谱覆盖、准确性和速度成为主导技术，但其灵敏度和空间分辨率受限于非相干光源。量子级联激光器（QCL）的发展带来了突破，催生了激光直接红外（LDIR）和光学光热红外（O-PTIR）等新型QCL基IR技术，显著提升了分辨率、灵敏度和速度，并支持多模态测量。然而，这些新兴技术与经典FTIR之间的可比性尚未被系统阐明。此外，光谱测量中使用的基底（如CaF₂、硅、MirrIR）对光谱质量有显著影响，但不同基底间的差异及与技术的交互作用也缺乏全面比较。因此，开展这项研究旨在系统评估不同IR技术（FTIR、O-PTIR、LDIR）和不同基底对光谱变异性的影响，为多中心研究和标准化提供参考。

**研究内容与结论**

研究人员选取六种代表性生物相关样品（ATP、脑脂提取物、胆固醇、糖原、溶菌酶和尿素）和三种常用基底（CaF₂、硅、MirrIR），采用三种IR技术（FTIR、O-PTIR、LDIR）进行测量。主要测量模式为单点模式，另对脑脂和尿素样品进行映射模式测量以评估样品异质性。通过分析谱带强度、谱带位置、谱带宽度和基于Pearson相关系数的光谱相似性，量化了样品异质性、IR技术和基底三个来源的变异性。结果表明：LDIR测量结果与FTIR和O-PTIR存在显著差异；CaF₂基底表现出最佳稳定性，优于MirrIR和硅；基底对谱带位置有显著影响，而不同IR技术间的变异性未呈现清晰模式。该研究提醒科研人员，在多中心研究和比较研究中必须考虑跨技术和跨基底的光谱变异性，该论文发表在《RSC Advances》。

**关键技术方法概述**

本研究主要采用了三种IR光谱技术：（1）傅里叶变换红外（FTIR）光谱，在透射模式（CaF₂和硅基底）或反射模式（MirrIR基底）下测量，光谱分辨率4 cm^-1，范围4000-900 cm^-1；（2）光学光热红外（O-PTIR）光谱，在反射模式下使用两种探测波长设置（O-PTIR-LS：532 nm和785 nm探测激光，泵浦QCL覆盖2999-973 cm^-1；O-PTIR-R：仅785 nm探测激光，泵浦QCL覆盖2922-934 cm^-1），光谱分辨率6.6 cm^-1；（3）激光直接红外（LDIR）光谱，在反射模式下使用MirrIR基底，光谱分辨率4 cm^-1，范围1800-975 cm^-1。所有测量均使用六种市售生化标准品（无特定队列来源），通过滴铸法在基底上制备薄膜。数据预处理采用SNIP基线校正和归一化，变异性分析基于欧氏距离和Pearson相关系数，并选取七个特征谱带计算位置、宽度和强度。

**研究结果**

**3.1 单点红外光谱结果**

通过单点测量，研究人员比较了不同技术和基底下的光谱。预处理后的光谱显示，大多数情况下各测量结果相似，但LDIR测量结果明显不同于其他技术，特别是尿素和糖原在1550-1800 cm^-1和1100-1200 cm^-1区域出现显著差异。基于欧氏距离和1-Pearson相关系数的光谱相似性分析（图2）表明：LDIR与FTIR、O-PTIR明显分离；FTIR和O-PTIR之间差异较小；MirrIR基底上的测量结果与CaF₂和硅基底相比差异显著，且CaF₂和硅基底间差异较小。进一步分析七个特征谱带（图3）发现：谱带位置偏移方面，多数偏移在±1.5 cm^-1内，但1665 cm^-1谱带在MirrIR基底上发生蓝移，在CaF₂和硅基底上发生红移，表明基底对谱带位置有显著影响（Mann-Whitney U检验证实部分谱带显著）；谱带宽度和强度在不同测量间随机变化，未与技术或基底呈现明确相关性，且光谱分辨率差异（FTIR/LDIR的4 cm^-1与O-PTIR的6.6 cm^-1）对窄谱带宽度无显著影响。

**3.2 红外成像结果**

研究人员对脑脂和尿素样品进行映射测量，以评估样品异质性。光谱图（图S10、S11）显示：CaF₂基底上的测量标准偏差最小，稳定性最高，其次为硅和MirrIR；LDIR光谱与其他技术差异明显；MirrIR基底上的光谱与其他基底存在可见差异。基于谱带面积的假彩色图（图S12-S14）和1-Pearson相关系数分析（图S16、S17）进一步证实：CaF₂映射的谱带面积标准偏差小，1-PCC均值和标准偏差均最低，表明样品异质性可忽略；基底间的变异性大于技术间的变异性，MirrIR基底导致更高的谱带面积和标准偏差，可能与反射效应有关。

**3.3 变异性来源的比较解释**

通过排除样品异质性的影响，研究人员将变异性来源归为IR技术和基底。结果显示，基底对谱带位置的影响更显著，而IR技术间的变异性未呈现清晰模式，仅LDIR与FTIR、O-PTIR存在显著差异。但需注意，LDIR测量仅在MirrIR基底上以反射模式进行，因此无法将变异性完全归因于LDIR技术本身、基底或测量模式。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究揭示了IR测量中跨技术和基底的光谱变异性，且基底对谱带位置的影响尤为关键，这与样品-基底折射率匹配、界面反射和干涉效应有关。谱带宽度和强度的随机变化可能源于形态、结晶度、厚度等基底依赖的样品特性。研究结论翻译如下：在本研究中，研究人员使用三种不同IR技术和三种常用基底，调查了IR测量的可比性。六种物质在单点模式下分析，其中两种额外在映射模式下测量。光谱变异性从谱带位置、谱带宽度、谱带强度（面积）和光谱相似性指标进行了基准测试和说明。总体而言，LDIR被证明与FTIR和O-PTIR存在显著差异，而CaF₂在所研究样品中普遍提供最佳稳定性，其次为硅和MirrIR。基于IR映射分析证明样品异质性可忽略后，研究人员将变异性来源分为IR技术和基底。两种来源均以不同方式引起光谱变异性。尽管IR技术间存在较大变异性，但未观察到IR技术与变异性之间的清晰模式。另一方面，基底在谱带位置中起关键作用，这可归因于样品-基底折射率匹配等因素，这些因素对样品-基底界面效应（包括干涉和反射）至关重要。