机器学习驱动设计用于神经发生增强成骨的多组分骨无机基质仿生支架

《Advanced Science》：Machine Learning-Driven Design of Multicomponent Bone Inorganic Matrix Mimicking Scaffolds for Osteogenesis Enhanced by Neurogenesis

　　

骨缺损需要具有成骨、神经发生和血管生成活性的材料，然而在高维组分空间中设计此类材料仍然具有挑战性。在此，研究人员报道了一种机器学习驱动的策略，以加速多组分介孔生物活性玻璃的设计。包含169个配方的数据集被用于训练支持向量机(SVM)模型，以将成骨潜力分为两类：高（相对ALP活性 ≥0.83）和低（相对ALP活性 <0.83）。该模型筛选了10,000个候选物，并确定了126个具有高潜力。随后使用骨髓间充质干细胞对这126个候选物进行实验性矿化测定，并选择了四个高性能候选物（候选物2–5）和一个较低性能的对照（候选物1）。通过同轴静电纺丝技术，将相应的MBG核心（MBG1-MBG5）结合到负载神经生长因子(NGF)的丝素蛋白(SF)壳中，制备出核-壳结构纳米纤维支架。其中，MBG5@SF/NGF表现出最高的成骨活性，促进了BMSCs的存活、分化、基质矿化和Erk1/2磷酸化，并上调了成骨和神经诱导标志物。转录组测序证实了成骨和神经发生通路的激活。在小鼠颅骨缺损模型中，MBG5@SF/NGF重建了神经-血管-骨再生微环境。研究人员得出结论，ML加速的筛选级联，结合实验验证，确定了MBG5@SF/NGF是一种用于功能性骨再生的有前景的支架。

骨组织在人体中发挥着结构支撑、保护内脏和促进运动及造血等关键功能。由战伤、肿瘤切除或先天性疾病引起的骨缺损给临床带来了巨大挑战。理想的骨移植材料不仅需要具备骨传导性和骨诱导性，还必须具有神经营养支持和血管生成潜力，以实现功能性骨再生。天然骨组织的无机相中，超过90%为羟基磷灰石，其余约10%由钠、钾、镁、锶等关键功能离子组成。这些微量元素在骨代谢中发挥着重要的调节作用，例如Na⁺和K⁺有助于维持细胞膜电位和渗透压平衡，Mg²⁺作为多酶辅因子参与骨形成，Sr²⁺能够双向调节破骨细胞和成骨细胞活性。然而，设计如多组分介孔生物活性玻璃(MBG)等仿骨无机基质涉及高维组分空间，传统的经验试错法效率低下，难以系统揭示各组分间的协同效应。为突破这一瓶颈，研究人员构建了一种机器学习(ML)驱动的筛选框架，用于设计多组分MBG，并验证了优化后支架的成骨和神经发生活性。研究发现，优化后的支架能够显著促进骨再生并伴随神经和血管再生，重建了神经-血管-骨再生微环境。该研究不仅设计了高效的骨修复材料，还建立了一个适用于多组分生物材料设计的通用框架。该论文发表在《Advanced Science》上。

研究人员构建了包含169种不同配方的实验数据集，并采用主成分分析(PCA)、t-SNE等降维方法进行可视化分析。通过训练支持向量机(SVM)等八种机器学习算法模型，对10000个虚拟生成的候选配方进行成骨潜力预测筛选。随后利用骨髓间充质干细胞进行实验验证和二次筛选。通过同轴静电纺丝技术制备了以MBG为核心、负载神经生长因子(NGF)的丝素蛋白(SF)为壳层的核-壳结构纳米纤维支架。最后，利用6周龄雄性C57/BL6小鼠构建颅骨临界尺寸缺损模型进行体内验证，并结合转录组测序探讨分子机制。

2.1 Dataset and Model Performance 数据集与模型性能
研究人员利用均匀设计策略设计了169种候选配方，并评估了BMSCs的存活和成骨诱导能力。采用相对碱性磷酸酶(ALP)活性作为评价指标。PCA投影图和t-SNE非线性降维结果显示，高相对ALP活性样本存在聚集趋势。前两个主成分(PC1和PC2)分别解释了41.9%和21.0%的方差。组分影响力分析表明，Ca元素在组分空间结构中具有最大的影响力。通过比较八种机器学习算法，SVM模型在处理小样本、高维数据时表现出最佳的综合预测性能。

2.2 Screening of Optimal Formulations 最优配方筛选
基于SVM模型，对10000个虚拟候选物进行预测，识别出126个高成骨性能候选物。通过PCA降维和散点图矩阵分析了组分间的相互作用关系。设定0.95为吸光度阈值绘制了箱线图。随后对所有候选材料进行茜素红S染色定量评估，最终筛选出4个具有最高矿化结节沉积的高性能实验组（候选物2-5）和1个较低性能对照组（候选物1）。

2.3 Algorithm Workflow 算法工作流程
该工作流程包括数据预处理与特征工程、多模型比较与优化以及最终模型部署预测筛选。在数据预处理中，基于0.83的相对ALP活性阈值分配二元分类标签，并应用合成少数类过采样技术(SMOTE)解决类不平衡问题。最终优化的SVM模型成功从10000个候选物中筛选出126个高潜力候选物，并通过定量分析验证了工作流程的有效性。

2.4 Material Characterization 材料表征
BET测试证实了MBG介孔结构的成功制备。离子释放实验显示MBG5表现出最稳定的释放动力学。通过同轴静电纺丝制备的核-壳结构支架在荧光染色下得到确认。扫描电子显微镜(SEM)观察到了交织的纤维结构。体外矿化实验表明，高成骨性能组的矿化效果优于低性能组和对照组。

2.5 Osteogenesis Determination 成骨作用测定
研究人员检测了支架对BMSCs存活、分化和矿化的影响。结果表明，MBG5@SF/NGF支架在细胞存活、ALP活性和钙结节形成方面表现最佳，并具有优异的拉伸模量和抗菌性能。细胞迁移和粘附实验进一步证实了MBG3@SF/NGF和MBG5@SF/NGF支架在促进BMSCs粘附和向支架内部迁移方面的优越性。

2.6 Correlative Analysis of Signaling Pathways During Osteogenesis 成骨过程中信号通路的相关性分析
研究人员检测了Erk1/2信号通路的磷酸化水平，发现MBG5@SF/NGF支架显著促进了Erk1/2的磷酸化。同时，成骨特异性标志基因和蛋白（如Runx2、Bmp2）的表达水平显著上调。免疫荧光染色显示Runx2和Bmp2在细胞核内具有较高的荧光强度，表明这些支架通过提高p-Erk1/2水平和上调Runx2及下游成骨基因来促进BMSCs的成骨分化。

2.7 Neurogenesis Determination 神经发生测定
通过检测BMSCs诱导神经分化细胞的存活和标志物表达，研究人员发现MBG3@SF/NGF和MBG5@SF/NGF支架显著提高了细胞存活率和神经元特异性标志基因及蛋白（如Map、Nse）的表达。免疫荧光显示这些细胞呈现出神经元样形态，表明支架具有有效的神经诱导活性。

2.8 Transcriptomic Sequencing Reveals a Global Osteogenic Regulatory Network 转录组测序揭示全局成骨调节网络
RNA测序结果表明，不同支架组之间存在差异基因表达。基因集富集分析(GSEA)、基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示，MBG5@SF/NGF支架显著富集了与成骨、胶原蛋白合成和能量代谢相关的通路（如BMP-SMAD、MAPK和HIF-1信号通路）。此外，MBG5@SF/NGF还富集了多巴胺能突触通路，为其神经调节功能提供了分子水平的解释。

2.9 Osteogenesis in Vivo 体内成骨研究
在小鼠颅骨临界尺寸缺损模型中，MBG5@SF/NGF支架移植组展现出显著优越的新骨形成能力，骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨矿物质密度(BMD)均显著高于其他组。组织学染色显示该组形成了丰富的骨组织和规则的骨小梁结构。免疫组化分析证实了Bmp2、Ocn、Nse和CD31在新骨形成区域的高表达，表明该支架有效重建了生理调节的骨再生微环境。

讨论部分总结了理想骨修复材料应具备调节局部再生微环境的能力。研究人员提出的ML加速筛选策略成功从多组分MBG配方空间中筛选出具有优异成骨性能的配方。MBG5@SF/NGF支架表现出超越单一成骨功能的综合生物学特性，不仅通过p-Erk1/2-Runx2轴促进成骨，还通过释放NGF促进神经发生，进而通过旁分泌信号增强成骨，形成成骨与神经发生相互促进的正反馈循环。尽管在4周的观察期内发现了炎症细胞浸润，但这符合正常的异物反应，且在Sr²⁺和Mg²⁺的免疫调节作用下逐渐缓解。

结论部分翻译如下：
在本研究中，研究人员构建了一种ML驱动的筛选策略，用于设计多组分MBG基支架，并在体外和体内验证了其成骨和神经发生功能。研究发现，优化的MBG5@SF/NGF支架通过p-Erk1/2激活的Runx2信号通路促进BMSCs的成骨分化。值得注意的是，该支架还增强了神经诱导特性，表现为神经特异性标志物表达升高和神经元样形态发育。此外，在临界尺寸小鼠颅骨缺损模型中，MBG5@SF/NGF支架稳健地刺激了新骨形成，并伴随神经向内生长和血管化。综上所述，本研究不仅提出了一个用于设计复杂生物材料的ML加速框架，还提出MBG5@SF/NGF作为用于神经血管化骨再生的最有前景的多功能支架。