《GLIA》：Pathogenic Variants in HEPACAM Alter Protein Localization and Interactome in Astrocytes of the Developing Mouse Cortex
编辑推荐：
摘要翻译：伴有皮质下囊肿的巨脑性白质脑病（MLC）是一种罕见的白质营养不良，其特征为早发性巨头畸形、白质水肿、癫痫发作以及运动和认知功能衰退。约25%的MLC患者携带HEPACAM致病性变异，其中许多是导致缓解型MLC 2b型的显性错义变异。HEPACAM编码
摘要翻译：伴有皮质下囊肿的巨脑性白质脑病（MLC）是一种罕见的白质营养不良，其特征为早发性巨头畸形、白质水肿、癫痫发作以及运动和认知功能衰退。约25%的MLC患者携带HEPACAM致病性变异，其中许多是导致缓解型MLC 2b型的显性错义变异。HEPACAM编码肝和胶质细胞黏附分子（hepaCAM），又称GlialCAM，是一种星形胶质细胞富集的跨膜蛋白，在星形胶质细胞领地建立、间隙连接耦联、分支组织、突触功能以及胶质血管单元发育中发挥重要作用。致病性HEPACAM变异在体内如何改变hepaCAM蛋白功能并在脑发育过程中促进MLC发病的分子机制在很大程度上仍不清楚。研究人员使用新的病毒工具和基于邻近标记的蛋白质组学方法，检测了三种不同的显性致病性变异如何改变发育小鼠皮层星形胶质细胞中hepaCAM的亚细胞定位和蛋白质相互作用组。研究人员发现，所有检测的突变体均表现出hepaCAM在星形胶质细胞中分布的显著改变。研究人员还观察到野生型和突变型hepaCAM之间的蛋白质相互作用组存在显著变化，包括与先前描述的hepaCAM相互作用蛋白Connexin 43和CLC-2的结合减少。此外，研究人员鉴定出癫痫相关钾通道KCNQ2为新的hepaCAM相互作用伙伴，并发现致病性变异与KCNQ2之间的结合减少。总之，这些数据为脑发育过程中星形胶质细胞中hepaCAM蛋白功能提供了新的见解，揭示了致病性变异的蛋白质动力学改变，并为探索MLC发病的分子基础提供了新的资源。
论文解读：
研究背景与目的：伴有皮质下囊肿的巨脑性白质脑病（Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, MLC）是一种罕见的早发性、缓慢进展的白质营养不良，主要特征包括巨头畸形、白质水肿、癫痫发作以及运动和认知功能衰退。大多数MLC病例由MLC1基因的隐性突变引起，约四分之一的病例由HEPACAM基因突变导致。HEPACAM编码肝和胶质细胞黏附分子（hepatic and glial cell adhesion molecule, hepaCAM），该蛋白是一种星形胶质细胞富集的单次跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在星形胶质细胞领地建立、间隙连接耦联、分支组织、突触功能和胶质血管单元发育中具有重要作用。HEPACAM的大多数致病性变异是位于细胞外IgV结构域的错义突变，其中显性杂合变异导致缓解型MLC 2b型，而隐性纯合变异导致进行性MLC 2a型。既往体外研究表明，MLC致病的hepaCAM突变会损害其定位于细胞-细胞连接的能力，并影响其与MLC1、CLC-2、Connexin 43（Cx43）等跨膜蛋白的相互作用。然而，致病性HEPACAM变异在体内如何影响发育过程中星形胶质细胞的hepaCAM蛋白定位和功能，此前尚未被探索。该研究旨在利用新的病毒工具和基于邻近标记的定量蛋白质组学，系统解析三种显性致病性变异（G89S、Q56P、D128N）在发育小鼠皮层星形胶质细胞中对hepaCAM亚细胞定位和蛋白质相互作用组的影响，从而为理解MLC的发病机制提供新的分子资源。
研究内容与主要结论：研究人员首先在星形胶质细胞-神经元共培养体系中验证了三种显性致病性变异（G89S、Q56P、D128N）对hepaCAM定位的影响，发现与野生型（wild type, WT）hepaCAM的斑点状分布不同，所有突变体均呈现广泛而均匀的细胞分布，并在突起末端出现超出细胞骨架范围的片状伪足样结构，提示突变损害了hepaCAM的顺式或反式同嗜性相互作用。随后，研究人员将WT及突变型人hepaCAM与TurboID和HA标签融合，包装为PHP.eB血清型腺相关病毒（AAV），在出生后第1天（P1）小鼠皮层内注射，并在P21时进行免疫组化分析。结果显示，与WT相比，三种突变体均显著增加了HA斑点密度并减小了斑点面积，表明体内星形胶质细胞中突变型hepaCAM的分布模式发生明显改变。此外，突变体还导致内源性小鼠hepaCAM的分布异常，尤其是在Q56P突变体中观察到环状结构。在蛋白质相互作用层面，研究人员通过免疫共标记发现，三种突变体与Cx43的共定位均显著减少，且Cx43斑点面积也明显减小。为进一步无偏地解析突变对hepaCAM相互作用组的影响，研究人员采用基于TurboID的邻近标记定量蛋白质组学，在P18-P21期间对小鼠进行生物素注射，随后通过链霉亲和素富集和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。共鉴定出3720个蛋白质。在WT hepaCAM相互作用组中，321个蛋白质显著富集，其中包括已知的相互作用伙伴MLC1、CLC-2、Cx43、GPRC5B等，并富集了细胞连接、质膜、细胞黏附等基因本体（GO）条目。与WT相比，三种突变体的相互作用组发生了显著变化：Q56P、G89S、D128N分别有43、34、25个蛋白质显著增加，以及33、40、46个蛋白质显著减少。共有14个蛋白质在三种突变体中均增加，包括GPRC5B、TTYH1和GPR37L1；22个蛋白质均减少，包括CLC-2和Cx43。值得注意的是，电压门控钾通道KCNQ2是三种突变体中减少最显著的蛋白质之一。通过三种颜色受激发射损耗（STED）超分辨显微镜，研究人员观察到内源性hepaCAM与KCNQ2在P21小鼠视觉皮层星形胶质细胞中共定位；通过免疫共沉淀实验进一步验证了hepaCAM与KCNQ2的直接相互作用，且致病性突变体与KCNQ2的结合明显减弱。网络分析显示，突变体增加的蛋白质网络富集于细胞黏附和细胞迁移相关生物学过程，而减少的蛋白质网络则富集于锚定连接、细胞连接和紧密连接等细胞组分，提示突变损害了hepaCAM作为跨膜蛋白分子组织者的功能，特别是在细胞连接处的蛋白质定位调控。该研究还发现，突变体与内质网钙稳态相关的氯通道CLIC样蛋白1（CLCC1）的关联也显著减少，提示hepaCAM突变可能影响内质网相关的离子调控功能。
技术方法概述：该研究采用的主要关键技术方法包括：（1）星形胶质细胞-神经元共培养体系，用于体外评估hepaCAM定位；（2）将人hepaCAM（WT及突变体）与TurboID和HA标签融合，包装为PHP.eB血清型AAV，通过P1小鼠脑内注射实现星形胶质细胞特异性表达；（3）基于TurboID的邻近标记定量蛋白质组学，结合链霉亲和素富集和LC-MS/MS分析，在体内鉴定hepaCAM相互作用组；（4）免疫共沉淀（co-IP）用于验证KCNQ2与hepaCAM的相互作用；（5）三种颜色STED超分辨显微镜用于观察内源性蛋白的纳米级共定位；（6）共聚焦显微镜和Synbot软件用于定量分析斑点共定位。样本来源于CD1小鼠和Aldh1l1-eGFP转基因小鼠（购自MMRRC），小鼠在P21时用于实验，蛋白质组学样本为每条件4只小鼠的皮层组织。
研究结果分述：
2.1 显性致病性变异改变与神经元共培养的星形胶质细胞中hepaCAM的定位：在星形胶质细胞-神经元共培养体系中，通过HA免疫标记观察发现，WT hepaCAM呈现特征性的斑点状分布，而G89S、Q56P和D128N突变体则广泛均匀分布于整个细胞，并在突起末端出现超出GFP标记细胞范围的片状伪足样突起。定量分析显示，三种突变体的HA信号总面积占GFP面积的比例显著增加，且GFP范围外的HA信号也显著增加，但细胞面积无显著差异。这表明损害顺式或反式同嗜性相互作用的显性突变均导致类似的定位改变。
2.2 显性致病性变异改变发育小鼠皮层星形胶质细胞中hepaCAM的蛋白分布：通过AAV介导的体内表达，在P21小鼠皮层第5层星形胶质细胞中检测WT及突变型hepaCAM-Turbo-HA。与WT的斑点状分布相比，三种突变体均显著增加HA斑点密度并减小斑点面积。内源性小鼠hepaCAM在转导细胞中的分布也受到突变影响，尤其是Q56P突变体中出现小的环状结构。这些结果证明三种显性致病性变异在体内均改变hepaCAM的分布模式。
2.3 致病性变异与Connexin 43共定位减少：通过三重免疫标记和共定位定量分析，发现与WT相比，三种突变体的HA斑点与Cx43共定位的百分比和共定位斑点密度均显著降低。Cx43斑点密度在WT和突变体之间无显著差异，但突变体的Cx43斑点面积显著小于WT。这提示与Cx43共定位减少是三种显性致病性变异的共同特征。
2.4 hepaCAM和致病性变异相互作用组的无偏邻近蛋白质组学研究：利用TurboID邻近标记和LC-MS/MS，在WT hepaCAM相互作用组中鉴定出321个显著富集的蛋白质，其中包括已报道的相互作用伙伴MLC1、CLC-2、Cx43、GPRC5B等。基因本体分析显示细胞连接、质膜、细胞黏附等条目显著富集。与Cx43-BirA2星形胶质细胞亚蛋白质组比较，仅有17个重叠蛋白，说明该方法能够区分不同的膜蛋白网络。
2.5 显性致病性变异改变hepaCAM蛋白质相互作用组：通过比较WT与突变体的蛋白质丰度，发现三种突变体中显著增加和减少的蛋白质数量有限，但有14个增加和22个减少的蛋白质为三种突变体共有。已知相互作用蛋白CLC-2和Cx43在突变体中显著减少，而GPRC5B、TTYH1和GPR37L1显著增加。KCNQ2是减少最显著的蛋白之一。通过STED和免疫共沉淀验证了KCNQ2为新的hepaCAM相互作用伙伴，且突变体与KCNQ2的结合显著减弱。共定位分析进一步证实突变体与KCNQ2的共定位百分比降低，但KCNQ2的整体分布变化较小。
2.6 hepaCAM突变体中增加和减少的蛋白质网络分析：对显著变化的蛋白质进行STRING网络分析，发现增加的蛋白质网络显著富集于细胞黏附和细胞迁移相关生物学过程；减少的蛋白质网络显著富集于锚定连接、细胞连接和紧密连接等细胞组分。这提示致病性变异可能损害hepaCAM与其他细胞连接蛋白的相互作用，影响其分子伴侣功能。
讨论与结论总结：该研究利用新的病毒工具、超分辨显微镜和基于邻近标记的定量蛋白质组学，系统揭示了三种显性HEPACAM致病性变异在发育小鼠皮层星形胶质细胞中对hepaCAM蛋白定位和相互作用组的显著影响。研究发现，所有突变体均改变hepaCAM的亚细胞分布，并导致与Cx43、CLC-2等已知相互作用蛋白的关联减少，同时新鉴定出KCNQ2为hepaCAM的相互作用伙伴，且突变体与KCNQ2的结合减弱。网络分析提示突变体增加与细胞黏附、迁移相关蛋白的关联，减少与细胞连接蛋白的关联，这可能反映了突变蛋白无法正确定位至细胞连接，进而损害其作为跨膜蛋白分子组织者的功能。研究还发现内质网相关的CLCC1蛋白与突变体的关联显著减少，提示hepaCAM可能在内质网离子稳态中发挥作用。该研究的局限性包括使用病毒过表达系统可能导致非生理水平的蛋白表达，以及仅研究了皮层灰质原浆性星形胶质细胞，未涉及白质星形胶质细胞。然而，该研究提供了发育皮层星形胶质细胞中hepaCAM相互作用组的全面资源，为理解MLC的分子病理机制奠定了重要基础。研究结论为：HEPACAM显性致病性变异在体内改变hepaCAM蛋白的亚细胞定位和蛋白质相互作用组，其中与Cx43、CLC-2和KCNQ2的关联显著减弱，这些变化可能在MLC的发病机制中发挥关键作用。论文发表在《GLIA》。
