探究靶向SARS-CoV-2主蛋白酶Mpro的萘酚类抑制剂结合模式

《ChemMedChem》：Investigating the Binding Mode of a Naphthol-Based Inhibitor Targeting SARS-CoV-2 Main Protease

　　

尽管全球为对抗引起SARS-CoV-2综合征的病毒付出了巨大努力，但在2019年之后的数年里，该感染仍是世界范围内一项重大健康挑战。为此，靶向病毒主蛋白酶（main protease，Mpro）已被提出作为开发有效且安全COVID-19抗病毒药物的一种可行且特别有前景的策略。研究人员通过应用一种整合工作流，将先前开发的计算机共识排序（consensus ranking）方案与两种正交体外方法相结合，对NCI/DTP化合物库进行筛选，报道了发现一种具有Mpro抑制活性的全新萘酚骨架。该命中化合物通过X射线晶体学（X-ray crystallography）与等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）在结构和结合热力学方面进行表征，测得结合亲和常数（binding affinity constant）为1.55 μM。该化合物进一步在病毒感染细胞中评价，测得EC50值为7.23 μM，毒性与nirmatrelvir相当。研究人员还借助化学合成以优化对新命中化合物的构效关系（structure–activity relationship，SAR）探索。通过整合计算、生物物理与酶学方法，所提方法能够将结构假设与功能证据结合，并展现出识别与理性优化结构新颖的非共价Mpro抑制剂的能力。

研究背景：SARS-CoV-2持续进化及抗病毒耐药的出现对全球健康构成长期挑战，开发新型抗病毒药物十分必要。主蛋白酶（M^pro，亦称3C样蛋白酶3CL^pro）因催化病毒多蛋白pp1a/pp1ab加工、底物P1位需谷氨酰胺且与人蛋白酶不同，成为安全、选择性高且保守的抗病毒靶点。已有nirmatrelvir/ritonavir、ensitrelvir、leritrelvir等共价或非共价抑制剂上市或进入临床，但化学多样性仍需拓展。本研究旨在从公开库中发掘结构新颖的非共价M^pro抑制剂并阐明其结合模式。

主要关键技术方法：研究人员采用基于配体与基于结构相结合的共识排序虚拟筛选，以NCI/DTP库（约26万条目）为对象，以已知非共价抑制剂compound 26为查询，联合ROCS三维形状/药效团相似性与Canvas二维指纹相似性，经共识排序、交叉对接（cross-docking）预优化及多样性筛选获57个候选；以重组SARS-CoV-2 M^pro（及C145A突变体，源自Addgene质粒转化BL21(DE3)）为材料，并行使用差示扫描荧光法（DSF，250 μM配体）与FRET肽酶活检测（50 μM配体）正交验证；通过ITC（25 °C）测定热力学参数，X射线晶体学（1.9 ?，PDB 32NU）解析复合物，VeroE6/TMPRSS2细胞（感染BavPat1株，D614G）qRT-PCR测EC₅₀/CC₅₀，并合成9个类似物做SAR。

研究结果：

2.1 计算机共识方法：因M^pro活性腔大且柔性高、缺乏结构数据，研究人员改用更快配体相似筛选。以compound 26作查询，ROCS得约3.25万唯一结构，Canvas三种指纹得超10万列表，共识交集1.95万；再用34个已知非共价配体-蛋白复合物交叉对接优化Glide参数（vdW缩放0.8、含SP/XP），筛5000后多样性缩至57个候选。

2.2 顶级化合物生物物理与生化筛选：57个中NSC47924在DSF令T_m升约+3 °C，FRET中50 μM完全抑制酶活，两正交实验一致指向其为可靠命中。

2.3 命中化合物表征：NSC47924为低分子量萘酚衍生物，FRET剂量反应IC₅₀ 1.89±0.10 μM；ITC（野生型）K_d 1.55±0.24 μM，化学计量1:1，ΔH ?11.71 kcal/mol，?TΔS +3.79 kcal/mol；C145A突变体K_d 1.38 μM相近。竞争ITC中预孵肽底物后滴定呈平坦等温线，证明正交位点（orthosteric）与底物竞争。Vero细胞中EC₅₀ 7.23 μM，CC₅₀与nirmatrelvir可比，选择指数略低。

2.4 X射线晶体学与类似物合成：复合物晶胞1.9 ?，配体密度弱但明确位于活性腔近Cys145。萘酚环嵌入S1口袋（Leu141/Asn142/His163/Glu166/His172）作范德华接触，羟基与Asn142 backbone及侧链羰基成氢键（~2.9 ?，~125°），对位甲氧基苯胺伸向溶剂区。合成类似物表明2位羟基换甲氧（12）活性降20倍，证明羟基关键；苯胺邻位甲氧（7）IC₅₀ 2.95 μM无大变，大链取代（8、9）仍保持微摩尔级；亚胺中间体（3–6）因自身荧光干扰未测准但ITC示K_d 5.52 μM，整体支持晶体姿态为优势结合几何。

结论翻译：本研究中，结合理论与实验、兼顾配体-靶标互作结构与热力学特征的方法，成功发现了具病毒蛋白酶抑制活性的新型生物活性骨架。所述工作流在协同层面提供有价值洞察：实验中配体低占位与弱密度由ITC弥补以推测结合要件，类似物合成追加实验层验证假设并扩展SAR制图。萘酚体系在已上市/在研化合物（>85%含杂环核）中属例外，ChEMBL中仅4个β-萘酚衍生物有药理记录。NSC47924对M^pro抑制及COVID-19抗病毒活性使该骨架成为药物样化学空间中可供创新抗病毒开发的有趣区域。靶标参与、理化性质及脱靶效应需后续优化，但本报告数据为推进该骨架至高效安全抗病毒疗法提供了基础且多层一致的依据。

论文发表于《ChemMedChem》。