《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》：Expression and Localization of a Testis-Specific Heat Shock Protein (CfHSP70-2) During Spermatogenesis in the Spruce Budworm, Choristoneura fumiferana (Clem.)
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热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）在多种昆虫物种中对于适应环境胁迫至关重要。大多数害虫在夏季极端高温期间经历受精过程，这主要影响雄性睾丸发育和精子发生，但涉及的分子机制尚不清楚。几种HSPs在多种昆虫中仅存在于睾丸中，但其功能作用仍
热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）在多种昆虫物种中对于适应环境胁迫至关重要。大多数害虫在夏季极端高温期间经历受精过程，这主要影响雄性睾丸发育和精子发生，但涉及的分子机制尚不清楚。几种HSPs在多种昆虫中仅存在于睾丸中，但其功能作用仍不明确。在本研究中，研究人员在云杉芽虫（*Choristoneura fumiferana*，SBW）中鉴定了一种睾丸特异性ATP依赖性HSP，即CfHSP70-2。采用逆转录定量聚合酶链反应（Reverse transcript-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）和蛋白质印迹（western blotting）检测CfHSP70-2的组织和发育阶段特异性表达。此外，还检测了各种胁迫因子对睾丸中CfHSP70-2表达的影响。重要的是，CfHSP70-2首先在蛹后期被检测到，并在成虫阶段达到峰值。加热、饥饿或化学HSP激活剂均未刺激CfHSP70-2表达。免疫组织化学染色显示，CfHSP70-2主要存在于蛹后期和成虫阶段的圆形精子细胞中。研究人员讨论了CfHSP70-2在SBW精子发生中的潜在功能作用。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
热休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）作为分子伴侣，在昆虫应对环境胁迫（如极端温度、饥饿、干旱）中发挥关键作用。全球气候变暖导致极端高温事件频发，而多数昆虫害虫在夏季高温期经历受精过程，其中雄性生殖系统，尤其是睾丸发育和精子发生，对热胁迫尤为敏感。例如，果蝇（*Drosophila*）的精子发生比卵子发生更易受热胁迫影响；赤拟谷盗（*Tribolium castaneum*）的热浪暴露会降低精子数量和活力；家蚕（*Bombyx mori*）蛹期热休克可导致雄性不育。然而，热胁迫诱导雄性不育的分子机制尚不明确。现有研究多关注环境胁迫诱导HSPs表达，但对非胁迫条件下组织特异性HSPs（如睾丸特异性HSPs）在生殖发育中的功能知之甚少。云杉芽虫（*Choristoneura fumiferana*，SBW）是一种重要的北美森林害虫，其分布和种群动态受温度极端事件影响。研究人员此前鉴定了一种ATP非依赖性小HSP（CfHSP20.2），并发现其参与性腺发育和耐热性。此外，在SBW中鉴定了七种ATP依赖性HSP70s，其中两种在雄性中高表达，本研究聚焦于其中之一CfHSP70-2，旨在揭示其在睾丸发育和精子发生中的潜在作用。
**研究内容与结论**
本研究以加拿大安大略省北部来源的SBW为对象，通过RT-qPCR和Western blotting检测CfHSP70-2在mRNA和蛋白质水平的表达模式。结果表明，CfHSP70-2在雄性和雌性幼虫中表达极低，但雄性从蛹期开始升高，至成虫早期（第1-3天）达到峰值，随后逐渐下降。组织分布分析显示，CfHSP70-2仅在睾丸中检测到表达，在幼虫和成虫睾丸中的mRNA水平分别比全虫高182倍和472倍，提示其具有睾丸特异性。蛋白质水平上，CfHSP70-2分子量约70 kDa，仅在睾丸中表达，且表达模式与mRNA一致，即在蛹后期和成虫早期高表达。胁迫实验表明，热休克（37°C处理1小时）、饥饿（幼虫禁食5天）或注射血红素（hemin）和过氧化氢（H?O?）均未显著影响CfHSP70-2蛋白表达，而对照CfHSP20.2在热休克后表达升高，证实CfHSP70-2为非应激诱导型。免疫组织化学染色显示，CfHSP70-2信号在幼虫和早期蛹中极弱，在蛹后期和成虫期主要定位于圆形精子细胞和精子束中，尤其在成虫早期外周区域信号最强，但在成熟精子中信号较弱。H&E染色揭示了精子发生过程中睾丸形态变化，包括从幼虫期四叶结构到蛹期融合为单球体，并出现有核（eupyrene）和无核（apyrene）精子类型。
**关键技术与方法**
研究使用了以下主要技术：（1）RT-qPCR，用于定量CfHSP70-2 mRNA在不同发育阶段和组织中的表达水平，以翻译延伸因子-1α（Tef-1α）为内参基因，采用2
-ΔΔCT法计算相对表达量；（2）Western blotting，用于检测CfHSP70-2蛋白表达，使用针对CfHSP70-2 C端特异肽段（PSCARPASPGGPRVQE）制备的兔多克隆抗血清，并以GAPDH为内参；（3）免疫组织化学染色，通过石蜡切片和BCIP/NBT显色，定位CfHSP70-2在睾丸中的分布；（4）胁迫处理实验，包括热休克、饥饿、血红素和H?O?注射，用于评估应激响应；（5）H&E染色，用于观察睾丸组织学形态。昆虫样本由加拿大自然资源部大湖林业中心提供，所有实验均设至少4个生物学重复。
**研究结果**
1. **阶段和组织特异性表达**：RT-qPCR显示，CfHSP70-2 mRNA在雄性蛹期和成虫期高表达，成虫第1天最高，约为第5龄幼虫睾丸的15倍；雌性中表达始终极低。组织分布表明，CfHSP70-2仅在睾丸中表达，其他组织（如头、表皮、脂肪体、中肠、马氏管）均未检测到信号。
2. **蛋白质表达模式**：Western blotting证实CfHSP70-2蛋白在睾丸中表达，且在蛹后期和成虫早期达峰，与mRNA模式一致；幼虫期表达极低，成虫后期略有下降。
3. **胁迫响应**：热休克、饥饿、血红素和H?O?处理均不改变CfHSP70-2蛋白表达，表明其不受外源胁迫诱导，可能受内源发育信号调控。
4. **免疫定位**：CfHSP70-2主要定位于蛹后期和成虫期的圆形精子细胞，以及成虫期的精子束；在幼虫和早期蛹中几乎不可检测，且不表达于睾丸壁（tunica externa和tunica interna）。成虫后期（A5-A7），信号主要集中于退化的圆形精子细胞。
**讨论与结论**
本研究发现CfHSP70-2是SBW睾丸特异性HSP，其表达模式与精子发生后期（精子细胞分化）和成虫早期（精子成熟与交配）相关。与哺乳动物HSP70-2（如小鼠敲除导致不育）和果蝇Hsc70（调控精子细胞生长）不同，CfHSP70-2表达时间较晚，可能参与精子成熟和凋亡过程。胁迫实验表明，CfHSP70-2不响应热、饥饿或化学应激，提示其功能可能涉及非应激条件下的精子发育，而非保护性应激反应。免疫定位显示，CfHSP70-2在无核精子（apyrene）的圆形精子细胞中高表达，这与其他鳞翅目昆虫（如家蚕）中apyrene精子对受精必需性一致。此外，精子束中的表达可能参与精子运输或竞争。研究还观察到，CfHSP70-2表达下降与成虫期生殖细胞凋亡同步，推测其可能具有抗凋亡或促凋亡调节作用。总体而言，CfHSP70-2可能通过保护精子细胞或调节精子束功能，参与SBW精子发生和雄性生育力，为理解热胁迫诱导雄性不育的分子机制提供了基础。论文发表在《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》。未来研究需鉴定CfHSP70-2的相互作用蛋白，以阐明其具体分子通路。
