利用机械方法和水相双相系统从红色微藻中高效提取和纯化B-叶绿素

《Microchemical Journal》：Efficient extraction and purification of B-phycoerythrin from red microalgae using mechanical methods and aqueous two-phase systems

　　

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  水包液体系实现了B-藻红素的高效选择性纯化。
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  比较评估了五种机械提取方法对红藻中B-藻红素的回收效果。
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  所提出的工艺简单、成本效益高且环保。
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  实现了高回收率和改善的色素纯度。

引言

微藻是单细胞、真核、光合自养生物，存在于多种环境中，如水生、陆地和空气环境[1],[2]。其中一些微藻能够在恶劣环境中生存，并利用太阳能、水和无机营养物质将二氧化碳转化为复杂的有机化合物[3]。细胞中的色素含量是将微藻分为不同类别的特征之一，包括褐藻门（Phaeophyceae）、绿藻门（Chlorophyceae）、硅藻门（Bacillariophyceae）和红藻门（Rhodophyceae）。目前被低估和未充分利用的一个微藻群体是红藻。在该类群中，Porphyridium和Rhodella是研究最深入的两种，它们具有最基本的形态特征，根据种类和生长阶段的不同，大小范围从1到100微米不等[4]。特别是，微藻产业因其作为高价值化合物（如脂质、蛋白质、多糖、酚类和色素）的天然来源而受到经济上的关注[5]。在各种行业中，藻胆蛋白（Phycobiliproteins, PBPs）被用作荧光剂和药品、食品以及化妆品中的天然蛋白质染料[6]。PBPs具有多种显著特性，包括高消光摩尔系数、明显的斯托克斯位移（Stokes shift）、极低的荧光抑制、高荧光量子效率以及在可见光谱范围内的宽吸收范围。PBPs由水溶性、自动发光、颜色鲜艳且亲水的多肽链构成[7]。除了传统应用外，PBPs还用于开发抗菌、抗病毒[8]、抗炎、免疫调节、抗癌和抗衰老的治疗技术[9]。它们被广泛应用于制药领域，例如作为分子探针用于检测试剂盒的制备，以及在医学领域的荧光剂，如今在当代药物开发市场中受到越来越多的关注[10]。PBPs的价格因纯度和用途而异，每克价格从130美元到15,000美元不等。然而，当PBPs用于食品应用时，对纯度的要求通常较低；而在科学和医疗用途中，纯度要求更高，成本可能会增加100倍。2013年，PBPs的总市场价值超过6,000万美元[11]。微藻中主要存在的藻胆蛋白有藻红素（Phycoerythrin, PE，红色）、藻红蛋白cyanin（Phycoerythrocyanin, PEC，橙色）、藻蓝蛋白（Phycocyanin, PC，蓝色）和异藻蓝蛋白（Allophycocyanin，浅蓝色），每种蛋白在可见光谱中都有特定的吸收波长[12]。这些色素占可溶性微藻蛋白的40%，被用作天然色素。在食品行业中，染料非常重要，尤其是对于确保消费者接受度而言[13]。使用天然色素来源尤为重要，因为儿童是彩色产品的主要消费者，天然色素可以部分或完全替代人工色素，同时具有营养价值和降低食物毒性的效果[14]。从红藻Porphyridium中提取的PE是一个非常有吸引力的研究案例。据报道，B-PE可以作为食品、化妆品和制药行业的色素，也可以作为荧光标记[15]。藻红素表现出作为抗氧化剂的强大效果，能够清除有害自由基，具有抗炎作用，并能保护细胞免受生理变化的影响，同时对延缓衰老有显著效果[16]。高纯度B-PE的商业价值（定义为A565纳米和A280纳米吸光度比值大于4.0）可能达到每毫克50美元[17]。因此，开发有效的B-PE回收和纯化技术变得十分必要[18]。

藻胆蛋白（PBP）的提取需要破坏细胞结构以释放细胞内的蛋白质。这一过程需要利用渗透压变化、化学处理、冻融循环、浸渍、超临界流体、挤压、法国压榨或超声破碎等技术[19]。然而，在提取过程中可能会遇到挑战，例如细胞碎片、细胞器官、类胡萝卜素和叶绿素等杂质的干扰[20]。因此，选择合适的提取方法对于提高最终产品的浓度和纯度至关重要。在本研究中，我们采用了五种不同的方法从两种Porphyridium物种中提取藻红素。

纯化步骤通常包括沉淀、透析、凝胶过滤色谱和离子交换色谱等多种技术的结合，但这些方法的主要缺点是成本较高且步骤较多，导致产品损失[21]。尽管已有关于从红藻中提取B-藻红素的报道，但通过水包液系统（Aqueous Two-Phase Systems, ATPS）对其纯化的系统研究仍然有限。水包液系统（ATPS）是一种适用于生物分子纯化的有效技术[17]。它是一种液-液提取方法，涉及形成两种热力学不相容的水相，其中一个相由一种或多种聚合物和低分子量成分组成。在特定浓度和温度下，这些成分会分离成两种不同的液相——上相和下相，两者处于热力学平衡状态，并具有不同的物理化学性质和组成[22]。ATPS具有多个优势：高容量和高回收率、处理时间短、能耗低且易于放大。此外，由于两相都具有低表面张力和高水分含量，ATPS创造了生物相容性和无毒的环境，有助于保持生物分子的结构和活性，特别是降低了变性或功能丧失的风险[23]。

水包液体系常用于回收藻胆蛋白（PBPs），通常从上层液中分离出单一的PBP。这种方法可以作为多个阶段中的单独步骤使用，也可以与其他纯化技术（如膜超滤和硫酸铵沉淀）结合使用。PEG-盐系统最为常见，根据样品的分子量选择不同分子量的聚乙二醇（1000–6000），以及磷酸钾、磷酸铵和硫酸钠等盐类[24]。

本研究旨在评估不同提取方法从未充分研究的Porphyridium cruentum和Porphyridium菌株中提取藻胆蛋白的效果。此外，本研究提出了一种简化且高效的提取方法，并结合水包液系统（ATPS）进行纯化，以最大化产量、提高纯度并保持色素的完整性。

章节片段

培养基和培养条件

Porphyridium cruentum和Porphyridium菌株是两种不同的红藻。微藻细胞在Guillard和Ryther先前开发的F/2培养基中培养[25]。F/2培养基的成分包括NaCl（27克/升）、MgCl₂.7H₂O（5.6克/升）、CaCl₂.2H₂O（1.55克/升）、MgSO₄.7H₂O（6.6克/升）、NaH₂PO₄（5毫克/升）、KH₂PO₄（70毫克/升）、NaHCO₃（40毫克/升）、NaNO₃（75毫克/升）、KNO₃（1克/升），以及1毫升金属溶液（金属溶液在MilliQ水中配制，含有Na₂.EDTA.2H₂O（4.36克/升）和CuSO₄.5H₂O）[26]

监测两种Porphyridium菌株的生长情况

Porphyridium cruentum和Porphyridium菌株是单细胞红藻，以其红色色素和合成高附加值生物分子（如B-藻红素、藻蓝蛋白等）、外多糖、淀粉和脂质的能力而闻名[27]。这些微藻生长速度快，能适应多种培养条件[28]。图1显示了P. cruentum和P. sp.在标准培养条件下的生物量。P. cruentum的干重

结论

本研究表明，从Porphyridium菌株中提取藻胆蛋白的效率因细胞破坏方法而异：使用珠剂超声破碎（60分钟）可最大化P. cruentum的B-PE产量（6.4%）；而冻融循环则同时提高了P. sp>的产量（2.5%）和纯度（2.1%）。随后的ATPS纯化显著提高了两种菌株的色素质量，P. sp>的纯度提高了5倍以上（从0.8%提高到5.5%），P. cruentum的纯度提高了约4倍（从1.2%提高到3.9%）[29]

CRediT作者贡献声明

Ameni Boudabbous: 方法学、实验设计、数据分析、概念构建。Adem Gharsallaoui: 实验设计、数据分析、数据整理。Emilie Dumas: 方法学、数据分析、数据整理。Slim Abdelkafi: 方法学、实验设计、资金获取、数据分析。Hajer Ben Hlima: 方法学、实验设计、资金获取、概念构建。

[39], [40]

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

本研究得到了法突计划（PHC UTIQUE-Code CMCU 24G0902）的资助。

Ameni Boudabbous|Adem Gharsallaoui|Emilie Dumas|Slim Abdelkafi|Hajer Ben Hlima