: 酶解蛋壳膜促进与PKC和Akt信号通路相关的角质形成细胞分化

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Enzymatically Hydrolyzed Eggshell Membrane Promotes Keratinocyte Differentiation Associated With PKC and Akt Signaling Pathways

　　

皮肤衰老的特征是生理和形态变化，营养干预是缓解这一过程的关键策略。蛋壳膜（ESM）是鸡蛋加工的天然副产品，通常作为工业废料被丢弃；然而，最近的研究揭示了其健康益处，包括抗肥胖和抗炎作用。研究人员之前曾报道，酶解ESM（eESM）能促进NHEK-Neo细胞中的角质形成细胞分化，尽管其潜在机制仍不清楚。在这项研究中，研究人员展示了用不同浓度的eESM处理NHEK-Neo细胞上调了角质形成细胞分化标记物（KRT1, KRT10, IVL, FLG, KRT13）并诱导了剂量依赖性的形态变化。钙是角质形成细胞分化的关键调节因子，存在于eESM中。补充钙显著增加了早期分化标记物（KRT1, KRT10）的转录，但对晚期标记物（IVL, FLG, KRT13）影响不大，表明eESM中的其他生物活性成分对分化有贡献。此外，eESM增强了PKC相关基因（IRF6, GRHL3, OVOL1）的表达并增加了Akt和ERK2的磷酸化。对PKC和Akt信号通路的药理学抑制抑制了角质形成细胞分化。超高效液相色谱分析进一步表明，eESM可能含有分子量约为1000 Da的成分，尽管需要进一步表征。总而言之，这些发现表明eESM促进与PKC和Akt信号通路相关的角质形成细胞分化，可能是通过钙和其他生物活性分子的协同作用，观察到的效果不能仅归因于钙。因此，eESM可能代表一种用于皮肤健康的潜在食品来源的功能性成分。

在发达国家中，人口老龄化正迅速增加，预计到2050年，全球60岁以上人口将增加22%。衰老涉及细胞代谢、生理和功能的时间依赖性变化，这与疾病发病率和死亡率的增加以及健康相关生活质量的下降有关。皮肤作为人体最大的器官，发挥着保护、体温调节和感觉感知等多种重要作用。人类皮肤不断受到内部和外部刺激，导致皮肤衰老的进展，表现为干燥、皱纹、头发变白、头发稀疏或秃顶以及皮肤变薄。皮肤衰老通常分为两种类型：时间性衰老和光老化。时间性衰老由激素变化和遗传倾向等内部因素驱动，难以调节。相反，光老化是由紫外线辐射、营养状况和化学污染物等外部因素引起的。因此，通过平衡营养、功能性生物活性化合物和护肤品等干预措施，光老化有可能被延缓。

蛋壳膜（ESM，一种位于蛋壳和蛋清之间的纤维状生物膜）约占鸡蛋结构的1.02%。它是鸡蛋加工的天然副产品，通常作为工业废料丢弃，增加了环境负担。在营养上，ESM由约90%的蛋白质、3%的脂质、2%的碳水化合物以及少量的钙和镁等矿物质组成。由于不溶性和蛋白质不稳定性，关于ESM中特定蛋白质的信息有限，但已知它富含纤维状蛋白质、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素和氨基葡萄糖，表明其在健康科学中具有潜在效用。先前的研究表明，粉末状ESM（pESM）在啮齿动物模型中表现出抗肥胖、抗炎和抗衰老作用。此外，研究人员先前的研究表明，酶解ESM（eESM，通过木瓜蛋白酶水解制备的ESM衍生物）能促进角质形成细胞分化，并恢复白细胞介素-10敲除小鼠的皮肤衰老表型，如皮肤厚度。这些发现表明，ESM含有能够减轻皮肤中与衰老相关的细胞功能障碍的生物活性化合物。

表皮作为皮肤的最外层，是角质形成细胞分化的部位。角质形成细胞的增殖局限于基底层，而分化发生在细胞迁移到棘层和颗粒层时。角质形成细胞分化的一个关键触发因素是细胞外钙水平的增加。钙离子流入角质形成细胞促进分化标志物的转录，如角蛋白（KRT1, KRT10, KRT13）、兜甲蛋白（IVL）、丝聚蛋白（FLG）和转谷氨酰胺酶1（TGM1）。这种钙诱导的分化受复杂的信号机制调节。其中一个重要分子是蛋白激酶C（PKC，一种被钙激活并促进角质形成细胞分化的激酶），它被钙激活并与受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4（RIPK4）相互作用以促进角质形成细胞分化。蛋白激酶B（Akt，一种在KRT1转录中起关键作用的丝氨酸/苏氨酸激酶）也发挥着关键作用，其缺失会导致表皮发育异常。此外，Notch信号通路对角质形成细胞生长停滞和分化启动至关重要。

鉴于ESM的潜在生物活性及其促进角质形成细胞分化的能力，其潜在分子机制仍有待阐明。因此，研究人员探讨了eESM诱导新生儿正常人类表皮角质形成细胞（NHEK-Neo，一种来源于新生儿包皮的角质形成细胞系）分化的潜在机制，并比较了eESM与其他ESM制剂（包括pESM和氢氧化钠水解ESM，hESM）中生物活性化合物的分子特性。研究人员得出结论，eESM含有促进角质形成细胞分化的生物活性化合物，该过程涉及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，一种参与细胞增殖和存活的激酶）-Akt和PKC信号通路，可能由瞬时受体电位香草酸亚型3（TRPV3，一种在角质形成细胞中表达的钙通透性阳离子通道）依赖的钙摄取介导。由于ESM通常作为工业废料丢弃，这些发现为其作为皮肤健康的功能性食品来源成分的潜在价值提供了见解，表明eESM可能是一种具有健康相关益处的可持续资源。该论文发表在《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》。

研究人员使用了从商业机构购买的NHEK-Neo细胞进行体外细胞培养。主要关键技术方法包括：实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR，用于检测基因表达水平的方法），通过提取总RNA并反转录为cDNA来量化角质形成细胞分化标志物及信号通路相关基因的表达；使用荧光试剂盒结合微板阅读器进行培养液中钙离子浓度的定量测量；利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具对先前的DNA微阵列数据进行上游分析，以筛选被激活或抑制的信号通路；通过蛋白质印迹法分析Akt和细胞外信号调节激酶（ERK1/2，一种参与细胞增殖和分化调节的激酶）的磷酸化水平；使用超高效液相色谱（UHPLC，一种分离和分析复杂混合物中化合物的分析技术）结合尺寸排阻色谱法来估计eESM中生物活性分子的分子量；并使用特定药理学抑制剂（GF109203X和LY294002）处理细胞以验证PKC和PI3K-Akt信号通路在分化过程中的作用。

3.1 不同浓度eESM对角质形成细胞分化的影响
研究人员通过显微镜观察和RT-PCR检测发现，用0.5至4.0 mg/mL的eESM处理NHEK-Neo细胞4天后，细胞形态转变为扁平外观，且这种形态变化随eESM浓度的增加而更加明显，呈现剂量依赖性。基因表达分析表明，eESM处理显著上调了KRT1、KRT10和KRT13的表达，且呈剂量依赖性。IVL、FLG和TGM1的表达也有所增加。由于KRT1和KRT10是早期分化标志物，KRT13、IVL和FLG是晚期分化标志物，这些结果表明eESM在形态和基因表达水平上均能促进角质形成细胞分化。此外，eESM显著上调了TRPV3的表达，表明TRPV3介导的钙信号参与了eESM诱导的角质形成细胞分化。

3.2 钙对角质形成细胞分化的影响
研究人员通过在培养基中添加不同浓度的氯化钙来处理NHEK-Neo细胞，发现钙处理的细胞与对照组相比出现聚集现象。早期分化标志物KRT1和KRT10呈剂量依赖性显著上调，证实了钙作为角质形成细胞分化启动子的作用。然而，晚期分化标志物IVL、FLG和KRT13仅略有增加，且其增加幅度不如eESM处理组明显。此外，TRPV3的表达在所有钙浓度下均未改变。这些结果表明，虽然钙是NHEK-Neo分化的关键启动子，但eESM诱导的分化不能完全由钙单独解释，因为4.0 mg/mL eESM所含的钙浓度（约0.8 mM）低于通常完全诱导角质形成细胞分化所需的水平（1.5至2.0 mM），暗示eESM中存在其他有助于观察到的效果的生物活性成分。

3.3 eESM诱导NHEK-Neo分化涉及的信号通路
基于先前的微阵列数据，研究人员使用IPA进行了上游分析，结果显示PKC信号通路被激活，而Akt信号通路受到抑制。为了进一步验证，研究人员通过RT-PCR检测发现，GRHL3和OVOL1等PKC相关基因在4.0 mg/mL eESM处理下显著增加。同时，通过蛋白质印迹法分析发现，与微阵列数据相反，4.0 mg/mL eESM显著增加了Akt在Ser⁴⁷³位点的磷酸化，pERK2/t-ERK2也有类似趋势。通过使用PKC抑制剂（GF109203X）和PI3K-Akt抑制剂（LY294002）进行药理学抑制实验，研究人员发现这两种抑制剂均消除了eESM诱导的细胞扁平化效应。基因表达分析进一步显示，PI3K-Akt信号主要调节早期分化标志物（KRT1和KRT10），而PKC信号主要影响晚期分化标志物（FLG和TGM1）。

3.4 eESM中生物活性分子大小的估计
研究人员使用UHPLC结合尺寸排阻色谱法，对eESM、pESM和hESM三种ESM制剂进行了比较分析。结果表明，pESM由于其高含量的不溶性蛋白质在过滤后几乎没有峰值。相反，hESM和eESM含有分子量在757至16,952之间的分子。通过叠加色谱图发现，eESM中靠近血管紧张素II（分子量：1046）的峰值比hESM更为突出。这一结果表明，eESM可能含有分子量约为1000 Da的生物活性成分。

在讨论部分，研究人员总结了eESM促进角质形成细胞分化的作用机制，指出该过程涉及PI3K-Akt和PKC信号通路，可能通过TRPV3依赖的钙摄取介导。虽然药理学抑制为这些通路的参与提供了证据，但研究人员也指出，未来仍需要使用小干扰RNA（siRNA）介导的基因敲低或恢复实验等遗传学方法，来确认PKC和PI3K-Akt信号在eESM诱导的角质形成细胞分化中的特异性。此外，研究中使用的eESM浓度是为了便于机制分析而选择的，可能超过了在饮食或局部暴露条件下生理上可达到的水平，因此需要进一步研究以确定这些浓度在体内的相关性，并评估eESM的转化潜力。

翻译研究结论部分：研究人员的发现表明，eESM含有促进角质形成细胞分化的生物活性化合物。这一过程似乎涉及PI3K-Akt和PKC信号通路，可能由TRPV3依赖的钙摄取介导。鉴于ESM是鸡蛋生产中通常作为工业废物丢弃的副产品，这些发现为其作为皮肤健康的功能性食品来源成分的潜在价值提供了见解。结合先前关于其抗肥胖、抗炎、抑制皮肤衰老、肠道生态失调和氧化应激的报道，eESM可能代表一种具有健康相关益处的可持续资源。然而，目前的发现基于体外实验，且尚未实现活性成分的鉴定。因此，需要进一步的体内研究和化合物鉴定来验证这些效果。