发酵蚕蛹蛋白在体外胃肠消化过程中功能、抗氧化及抗过敏特性的修饰

《Food Science & Nutrition》：Modification of Functional, Antioxidant, and Anti-Allergic Properties of Fermented Silkworm Pupae Protein During In Vitro Gastrointestinal Digestion

　　

蚕蛹蛋白（Silkworm pupae protein, SPP）是一种具有良好应用前景的替代蛋白，但其应用受到致敏性和功能特性欠佳的制约。本研究采用植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）Z4对SPP进行发酵，并对其进行体外胃肠消化，以评估其功能特性的稳定性和生物可及性。发酵提高了水解度、α-螺旋含量、表面疏水性和游离巯基含量，表明发生了结构重排。乳液稳定性得到改善，而起泡能力、泡沫稳定性和乳化活性未见显著变化。发酵还增强了抗氧化活性并降低了致敏性相关反应。消化后，未发酵和发酵样品均表现出更高的抗氧化活性和更低的致敏性相关反应，而发酵消化产物总体上比相应的未发酵消化产物表现出更强的抗氧化活性和更低的IgE抑制活性。这些发现表明，Z4发酵作为一种预消化修饰策略，可改善SPP的功能特性，而胃肠消化则为其功能特性的生物可及性提供了生理相关的评估。

**发酵蚕蛹蛋白在体外胃肠消化过程中功能、抗氧化及抗过敏特性的修饰——论文解读**

**一、研究背景与意义**

蚕蛹作为一种富含蛋白质的可食用昆虫资源，具有氨基酸组成均衡、营养价值高等优点，在食品及功能性配料开发领域展现出巨大潜力。已有研究表明，蚕蛹蛋白（Silkworm pupae protein, SPP）不仅具有优异的营养品质，还具备抗氧化、降血糖、降血脂及免疫调节等多种生物活性。然而，SPP的天然结构特征为致密的蛋白堆积和高度α-螺旋与β-折叠聚集，导致其溶解性差、乳化性和起泡性有限，限制了其在食品加工中的应用。更为关键的是，SPP中已鉴定出多种免疫原性和致敏性蛋白，这些蛋白可与IgE抗体结合，引发哮喘、荨麻疹、过敏性鼻炎甚至过敏性休克等一系列过敏反应，对消费者构成显著安全风险，成为SPP在食品工业中推广应用的主要障碍。

乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）发酵作为一种天然修饰技术，在食品工业中得到广泛应用。该技术可调控蛋白质构象，改善乳化性、起泡性和抗氧化活性等功能特性。然而，尽管LAB发酵已广泛用于改善植物蛋白和昆虫蛋白的功能特性并降低致敏性，但其对SPP的影响鲜有报道。SPP具有独特的结构和营养特征，可能对微生物修饰产生不同响应。以往研究鲜少探讨发酵驱动的结构改变与胃肠消化相结合对SPP功能和免疫学特性的影响。因此，本研究采用从传统发酵豇豆中分离的具有蛋白酶活性的植物乳植杆菌Z4，旨在区分两个相关但不同的效应：发酵本身对SPP的直接修饰作用，以及所得功能和抗过敏特性在模拟胃肠消化过程中的稳定性和生物可及性，从而评估发酵是否提供了超越单纯消化蛋白水解作用的额外益处。该论文发表在《Food Science》。

**二、主要技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用琼脂孔扩散法测定菌株蛋白酶活性；通过圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）分析蛋白二级结构；采用内源和外源荧光光谱评估蛋白三级结构变化；运用SDS-PAGE分析蛋白分子量分布；通过OPA法测定水解度；分别采用DPPH、ABTS自由基清除实验和铁离子还原抗氧化能力（Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP）法评价抗氧化活性；使用竞争性ELISA法测定IgE抑制活性；同时测定透明质酸酶抑制活性、起泡性、乳化性、表面疏水性和游离巯基含量等理化指标。研究样本为购自中国四川省成都市金堂县的新鲜蚕蛹。所有实验重复三次，数据以平均值±标准误表示，采用单因素方差分析和Duncan多重比较进行统计评估。

**三、研究结果**

**3.1 菌株形态学鉴定**

通过平板划线分离和革兰氏染色观察，研究人员确认所分离菌株为革兰氏阳性菌，在琼脂表面形成乳白色、光滑、湿润的单菌落。16S rDNA基因序列同源性分析显示，该菌株与已知植物乳植杆菌WILCCON 0030序列具有100%相似性，因此鉴定为植物乳植杆菌并命名为L. plantarum Z4。

**3.2 菌株蛋白酶活性及其对蚕蛹蛋白水解度的影响**

通过琼脂孔扩散法评估L. plantarum Z4的蛋白酶活性，结果显示菌株培养上清液周围出现清晰水解圈，表明该菌株具有蛋白水解能力。与未发酵对照相比，Z4发酵使SPP的水解度显著提高至7.50%±0.38%，说明L. plantarum Z4能够在发酵过程中水解蛋白底物。

**3.3 发酵对蚕蛹蛋白理化性质的影响**

研究表明，经Z4发酵后，SPP的起泡能力和泡沫稳定性与未发酵对照相比无显著变化。乳化活性指数（Emulsifying activity index, EAI）亦无显著变化，但乳化稳定性指数（Emulsifying stability index, ESI）显著提高，达到19.58±1.19 min。这表明发酵改善了SPP的乳液稳定性，而未显著影响其初始乳化活性。

**3.4 发酵对蚕蛹蛋白分子结构的影响**

圆二色光谱分析显示，未处理样品含21.67%±0.33% α-螺旋、34.00%±0.10% β-折叠、18.33%±0.67% β-转角及26.33%±0.13%无规则卷曲。经Z4发酵后，α-螺旋含量显著增加，而β-折叠含量显著降低。内源荧光光谱显示发酵后荧光强度降低，最大发射波长从361 nm红移至369 nm；外源荧光光谱（ANS探针）则显示荧光强度增加，最大发射波长从524 nm蓝移至522 nm，提示疏水区域暴露增加。游离巯基含量从未处理蛋白的3.13±0.01 μmol/g显著增加至发酵样品的4.75±0.11 μmol/g，表面疏水性从151.46±5.24显著增加至586.47±9.46。这些结果表明Z4发酵破坏了蛋白三级结构，导致分子展开和疏水残基暴露增加。

**3.5 体外消化后发酵蚕蛹蛋白分子量变化**

SDS-PAGE分析显示，发酵后66–80 kDa和35–42 kDa区域的蛋白条带变浅，42–52 kDa区域出现新条带，25–35 kDa条带增强。SPP和FSPP经模拟胃液（Simulated gastric fluid, SGF）和模拟肠液（Simulated intestinal fluid, SIF）消化后，水解度均显著增加，其中肠消化后达到最高值（约35%–37%）。虽然发酵在消化前提高了水解度，但模拟胃肠消化使SPP和FSPP均发生广泛水解，消化后分子量分布趋于相似。

**3.6 发酵和消化对蚕蛹蛋白抗氧化活性的影响**

DPPH和ABTS自由基清除活性以及FRAP值测定结果显示，发酵显著增强了SPP的抗氧化活性。体外胃肠消化后，SPP和FSPP的抗氧化活性均进一步增加，其中SIF消化产物活性最强。在相同消化条件下，FSPP表现出高于相应SPP组的抗氧化活性。这表明胃肠消化增强了两种底物的抗氧化活性，而Z4发酵提供了超越消化蛋白水解的额外益处。

**3.7 发酵和消化对蚕蛹蛋白致敏性的影响**

发酵增加了透明质酸酶抑制率并降低了IgE抑制活性，表明SPP致敏性相关反应降低。体外胃肠消化后，SPP和FSPP的透明质酸酶抑制率进一步增加，而IgE抑制活性进一步降低。在相同消化条件下，FSPP通常表现出略高的透明质酸酶抑制率和显著低于相应SPP组的IgE抑制活性。这些结果提示胃肠消化降低了两者的致敏性相关反应，而Z4发酵同样提供了额外益处。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，发酵诱导的SPP结构改变与功能特性变化、抗氧化活性增强和致敏性降低相关联。抗氧化活性的增强可能归因于发酵过程中释放的生物活性肽。体外消化进一步增强了SPP和FSPP的抗氧化活性，尽管消化后两者的水解度和SDS-PAGE图谱相对相似，但FSPP消化产物仍表现出更强的抗氧化活性，提示发酵可能改变了消化过程中的蛋白水解切割位点，促进了更多生物活性肽的释放。关于抗过敏机制，IgE结合作用于致敏阶段，而透明质酸酶影响效应阶段，两者的协同调节有助于整体抗过敏效果。

研究结论为：Z4发酵直接修饰了SPP的结构，在消化前增强了其抗氧化活性并降低了致敏性相关反应。胃肠消化进一步提高了SPP和FSPP的抗氧化活性并降低了致敏性相关反应。在相同消化条件下，FSPP消化产物总体上表现出比相应SPP消化产物更高的抗氧化活性和更低的IgE抑制活性，表明Z4发酵提供了超越消化蛋白水解的额外功能益处，并改善了SPP衍生组分的消化生物可及性。