《Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis》：In Vivo Micronucleus Assay: increased efficiency with an Automated Imaging System
编辑推荐：
•使用注射器过滤器可以更有效地去除残留的非红细胞。•自动化评分与手动显微镜检查在测量多色红细胞（MNPCE）频率方面结果一致。•红细胞富集会影响多色红细胞的比率（PCE），但不会影响单核细胞（MN）的解读。•同一张载玻片的分析以及跨载玻片的分析均支持评分的一致性。•历史对照数据支
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使用注射器过滤器可以更有效地去除残留的非红细胞。
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自动化评分与手动显微镜检查在测量多色红细胞（MNPCE）频率方面结果一致。
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红细胞富集会影响多色红细胞的比率（PCE），但不会影响单核细胞（MN）的解读。
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同一张载玻片的分析以及跨载玻片的分析均支持评分的一致性。
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历史对照数据支持该方法在不同物种和性别间的应用。
引言
基因毒性可能导致突变、染色体损伤、基因组不稳定、致癌作用以及遗传效应；因此，基因毒性是安全性评估中的关键指标[1],[2]。体内啮齿动物红细胞微核（MN）测试是一种成熟的方法，用于检测造血细胞中的染色体损伤[3],[4],[5]。该测试通常使用从大鼠或小鼠的外周血或骨髓中获得的红细胞进行[3],[4],[5],[6]。微核来源于在细胞分裂过程中未能整合到子细胞核中的非中心染色体片段或整个染色体。因此，多色红细胞（MNPCE）的频率可以作为细胞遗传毒性或染色体异常效应的指标[6],[7],[8]。
尽管这种测试被广泛使用[5]，但基于显微镜的手动评分方法存在一些实际限制。手动评分耗时且工作量大，并且评分者之间的差异可能影响分析的一致性和可重复性[9]。当需要分析大量细胞以提高检测低频事件的敏感性时，这些限制尤为明显。为了解决这些问题，已经开发了基于流式细胞术和计算机图像分析的自动化方法[10],[11],[12]。基于图像的系统具有多种优势，包括客观应用预先定义的评分标准、数字化存档分析结果、重复的视觉验证以及更高的处理通量。另一种用于红细胞MN分析的自动化方法是荧光激活细胞分选（FACS），该方法常用于分析表达CD71表面标记物的未成熟红细胞[10],[13]。FACS分析和基于图像的自动化评分在分析原理和标本处理方式上存在根本区别。FACS能够实现高通量分析，而基于图像的系统则可以保留染色载玻片上的细胞形态，允许重复查看存档图像，并便于进行回顾性评估而无需额外消耗标本。此外，当应用适当的红细胞富集和视觉确认程序时，基于形态的工作流程有助于区分真正的微核与其他细胞结构。因此，基于图像的自动化评分是一种实用的补充方法，适用于常规的GLP实验室，同时保留了传统显微镜制备方法的优点。
Metafer载玻片扫描系统及其相关的基于图像的评分软件平台已被证明是一种有用的MN分析工具[9],[11],[12],[14],[15],[16]。与手动显微镜相比，自动化图像分析可以大幅增加评估的红细胞数量，提高统计稳健性，并能够进一步表征红细胞亚群[9],[11],[12],[14]。在红细胞MN检测中，这一点尤为重要，因为MNPCE的频率以及未成熟红细胞和成熟红细胞的相对分布可以提供生物学上的有用信息。基于Metafer的工作流程也与常用于骨髓MN分析的Giemsa染色标本兼容[9],[14]。尽管通常建议使用DNA特异性荧光染料（如吖啶橙）进行MN评估，因为它们可以减少非DNA特异性染色引起的伪影并有助于区分红细胞的成熟阶段[4]，但本研究采用了传统的Giemsa染色骨髓标本，因为所使用的自动化Metafer工作流程适用于我们GLP实验室常规生成的载玻片。因此，本研究重点是通过预分析阶段的红细胞富集来提高标本质量，而不是更换染色方法。自动化图像分析还有助于同时评估多色红细胞（PCE）和正常色素红细胞（NCE），这对于根据经济合作与发展组织（OECD）测试指南474[4]解释造血效应具有重要意义。
在骨髓MN检测中成功实施自动化图像分析不仅取决于图像分析算法的性能，还取决于分析标本的质量。在外周血流式细胞术MN分析中，可以通过适当的门控排除有核白细胞。相比之下，用于基于图像识别的骨髓标本包含更多异质的红细胞和非红细胞混合体，包括粒细胞和其他有核造血细胞，这些细胞会留在染色载玻片上。这些残留的非目标细胞可能会被错误分类为红细胞或类似微核的结构，从而降低评分准确性并增加假阳性或其他不可靠结果的可能性。有效的红细胞富集和减少干扰细胞群是实现稳健自动化MN评分的关键前提。为了获得可靠和可重复的自动化分析，标准化预分析样本制备协议与图像分析算法本身同样重要。
在制备载玻片之前，进行富集红细胞并减少非目标有核细胞的过程至关重要。长期以来一直使用基于柱子的方法[14],[17]。尽管这些方法已经很成熟，但使用前需要人工组装，而且单个制备柱子的性能可能因装填体积、纤维素组成和处理条件而有所差异。商业注射器过滤器提供了一种标准化的即用格式，可能简化样本制备并提高程序一致性。然而，这些富集策略对载玻片质量、自动化评分性能以及与传统手动评估结果的一致性的影响尚未得到充分研究，这限制了基于图像的自动化评分在骨髓MN检测中的更广泛应用和标准化。
我们测试了使用注射器过滤器进行预分析阶段红细胞富集是否能够获得与传统柱子方法相当的载玻片质量和分析性能。我们使用Metafer载玻片扫描系统及其软件平台建立了自动化评分工作流程，并比较了基于柱子和注射器过滤器的富集方法对载玻片质量和评分性能的影响。评估了自动化评分结果与手动评分结果之间的一致性，并生成了自动化HCD值，以便与手动建立的实验室对照值进行比较，从而提供了关于基于图像的自动化评分的技术可行性和分析可靠性的信息。
章节片段
测试物质和试剂
蒸馏水（DW；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯；商品编号W3500）用作溶剂对照。硫酸乙基甲烷（EMS；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯；商品编号M0880）和环磷酰胺一水合物（CPA；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯；商品编号C0768）用作阳性对照物质。胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；商品编号26140-079）用于细胞分离。Hanks平衡盐溶液（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，
红细胞富集：柱子和过滤器方法的比较
为了优化基于图像的自动化MN评分，无论处理组如何，都使用纤维素柱子或注射器过滤器对研究动物的骨髓样品进行红细胞富集。典型的明场图像显示未处理的涂片中含有大量非红细胞细胞物质，而两种富集方法都减少了残留的非目标物质，其中过滤器富集的标本中残留物质最少
讨论
本研究表明，在体内骨髓MN检测中，如果在进行载玻片制备之前适当进行红细胞富集，基于图像的自动化评分可以产生与传统手动显微镜获得的分析结果相当的结果。MN检测是一种标准且广泛使用的体内基因毒性测试，长期以来人们认为自动化评分可以提高评分效率和客观性
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究得到了韩国毒理学研究所的动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号IAC-26-01-0082、IAC-23-01-0053、IAC-23-01-0039、IAC-23-01-0036、IAC-21-01-00373、IAC-22-01-0093、IAC-21-01-0062和18-1-0124）。
资助
本研究得到了韩国毒理学研究所的支持（KK-2603-02、KS-2601-02）。
CRediT作者贡献声明
Seong-Hoon Park：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。Nan-Young Kim：研究。Da Yeon Kim：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、数据可视化、研究、数据管理。Seng-Min Back：写作 – 审阅与编辑、撰写初稿、研究、数据管理。Na-Young Jeong：研究。Ho Bin Yi：写作 – 初稿撰写
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用ChatGPT（GPT-5.5，OpenAI）进行英语语言编辑和可读性改进。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审核和编辑，并对出版物的内容负全责。
Seng-Min Back|Da Yeon Kim|Ho Bin Yi|Na-Young Jeong|Nan-Young Kim|Seong-Hoon Park
