《Applied Microbiology and Biotechnology》：Efficient biotechnological production of N-(Hydroxycinnamoyl)tyramines by utilizing plant-derived enzymes in a bench-scale bioreactor with in situ product precipitation
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**摘要**
植物多酚生物活性物质的高效回收面临来自植物组织的低浓度和复杂混合物等技术挑战。为寻求替代方案，研究人员开发了一种在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中通过将可溶性底物转化为不溶性产物来高效生物技术生产羟基肉桂酸-酪胺缀合物的工艺。
**摘要**
植物多酚生物活性物质的高效回收面临来自植物组织的低浓度和复杂混合物等技术挑战。为寻求替代方案，研究人员开发了一种在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中通过将可溶性底物转化为不溶性产物来高效生物技术生产羟基肉桂酸-酪胺缀合物的工艺。通过共表达拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase, 4CL）和马铃薯（*Solanum tuberosum*）羟基肉桂酰辅酶A：酪胺N-(羟基肉桂酰)转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA:tyramine N-(hydroxycinnamoyl)transferase, THT），建立了重组植物酶级联反应。研究人员通过开发一种温度适应性且顺序分阶段的生物工艺，在1 L反应器规模上克服了初始酶学限制。在5 mM/h底物供给速率下，研究人员获得了31.9 g/L（102 mM）的阿魏酰酪胺（feruloyltyramine, FerT）、14.4 g/L（50.7 mM）的香豆酰酪胺（coumaroyltyramine, CouT）和14.6 g/L（46.5 mM）的异阿魏酰酪胺（isoferuloyltyramine, iFerT），FerT的时空产率为1.75 g·L?1·h?1。绝大部分产物以可过滤沉淀形式获得，相较于经典工艺简化了下游处理过程。经16–40 μm玻璃过滤器过滤后，来自FerT生产的洗涤滤饼显示出99%的FerT质量含量。重结晶后通过核磁共振（NMR）确认了产物身份。该新开发工艺稳健、成本效益高且可放大，为生物技术生产的羟基肉桂酸-酪胺类化合物的商业应用铺平了道路。
**要点**
- 低温下表达的植物来源酶可实现高生产率
- 原位沉淀的产物易于从发酵液中过滤
- 碳转移速率反映酚类物质的毒性并指导工艺优化
**论文解读**
**一、研究背景与意义**
羟基肉桂酸（hydroxycinnamic acids, HCAs）类化合物如香豆酸（coumaric acid, CouA）、阿魏酸（ferulic acid, FerA）和咖啡酸（caffeic acid, CafA）是植物中普遍存在的苯丙烷类代谢产物，广泛参与木质素、类黄酮、香豆素及二苯乙烯等次生代谢物的生物合成。在植物体内，大部分HCAs通过4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）活化为辅酶A硫酯，最终还原为木质素前体——单木质醇；而少量HCAs辅酶A硫酯则由羟基肉桂酰辅酶A：酪胺N-(羟基肉桂酰)转移酶（THT）转移至酚胺类化合物（如酪胺、色胺）上，形成羟基肉桂酸酰胺类化合物（hydroxycinnamic acid amides, HCAAs）。研究表明，HCAAs在植物抵御病原菌侵染的防御反应中发挥植物抗毒素作用，例如在烟草花叶病毒感染的烟草叶片、致病疫霉（*Phytophthora infestans*）感染的马铃薯叶片以及丁香假单胞菌（*Pseudomonas syringae*）感染的拟南芥叶片中均观察到阿魏酰酪胺（FerT）合成的显著上调。
HCAAs因其多样的生物活性而备受关注，包括抗氧化、抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗黑色素生成及神经保护等功效。其清除活性氧（ROS）的能力可归因于其化学结构中延伸的p轨道提供的共振稳定作用。研究表明，香豆酰酪胺（CouT）可通过抑制α-葡萄糖苷酶（IC
50为0.4 μM）来降低餐后血糖水平；FerT则可通过下调酪氨酸酶及相关酶的基因表达来抑制黑色素生成。然而，尽管HCAAs具有巨大的应用潜力，其药物和工业应用目前受限于植物提取的低产量以及化学合成的高成本和多步骤特性。生物技术合成途径提供了一种可持续的替代方案，但现有方法面临产物浓度低、产物分离繁琐、工艺周期长和工艺要求复杂等瓶颈。因此，开发一种高产率、简化的下游处理工艺对于实现HCAAs的商业化生产至关重要。
**二、研究内容与主要技术方法**
本研究旨在开发一种在大肠杆菌（*E. coli*）中高效生物技术生产羟基肉桂酸-酪胺缀合物的可放大工艺。研究人员构建了共表达拟南芥4-香豆酸辅酶A连接酶（At4CL2）和马铃薯羟基肉桂酰辅酶A：酪胺N-(羟基肉桂酰)转移酶（StTHT）的双顺反子表达载体pLigTrans，并将其转化至大肠杆菌BL21ΔtyrR（BL21 ΔR）菌株中。该菌株来源于BL21野生型菌株，在tyrR基因中插入了DE3的功能部分。研究采用双阶段生物工艺——先进行重组酶表达，再进行底物转化，在1 L台式生物反应器中系统考察了不同底物供给速率、诱导剂类型和反应温度对产物合成的影响。产物通过原位沉淀形成不溶性颗粒，采用16–40 μm玻璃过滤器进行过滤回收，并通过重结晶和NMR光谱进行产物纯化和结构确认。产物浓度采用高效液相色谱（HPLC）定量分析，细胞代谢活性通过在线碳转移速率（CTR）监测。所有发酵实验均在DasGip?平行生物反应器系统中进行，配备在线尾气分析仪。
**三、研究结果**
**3.1 FerT的生产验证与条件优化**
在摇瓶实验中，携带pLigTrans的BL21 ΔR菌株在IPTG诱导后，经24 °C表达3.5小时，然后添加0.5 mM FerA和0.5 mM TyN进行转化。结果表明，3小时后形成300 μM FerT，17小时后几乎完全转化。FerA的消耗时间曲线与产物形成相对应，而仅表达StTHT的阴性对照菌株中FerA水平保持恒定，证实了该表达构建体的功能性和酶的催化活性。
进一步优化实验显示，重组酶的表达温度对产物形成具有显著影响。在17 °C下表达的酶表现出最高的初始产物形成速率，其次是24 °C表达，而37 °C表达导致转化速率显著降低，5小时后产物形成量约降低两倍。SDS-PAGE分析表明，At4CL2在28 °C表达时虽然初始积累明显，但24小时后条带强度几乎消失，表明该酶在较高温度下不稳定。同样，反应温度的实验表明，30 °C的反应速率最快，而37 °C导致生产力最低，进一步证实了这些植物来源酶在高温下的不稳定性。
**3.2 生物反应器规模放大与产物合成**
在1 L生物反应器中，研究人员建立了多阶段发酵工艺，依次分为分批培养阶段、指数生长期、重组酶表达阶段（16 °C）和生产阶段（22–28 °C）。在5 mM/h底物供给速率下，经过10小时生产，总FerT浓度达到49.1 ± 15.6 mM；而1 mM/h和10 mM/h供给速率分别产生11.5 ± 3 mM和13.0 ± 5.9 mM FerT。值得注意的是，10 mM/h的高供给速率导致CTR持续下降和生产力丧失，而1和5 mM/h供给速率下CTR虽短暂下降但在0.5–5小时内恢复。研究发现CTR的暂时下降与FerT的暂时性过饱和浓度严格相关（n=4/4），表明高浓度可溶性FerT对细胞具有毒性作用。
在进一步的优化实验中，研究人员测试了诱导剂（IPTG与乳糖）和生产温度（22 °C与28 °C）的组合。结果表明，在26小时内，IPTG+22 °C、IPTG+28 °C和乳糖+28 °C三种条件下均达到约102 ± 3 mM（31.9 g/L）的最终产物浓度，而乳糖+22 °C条件下的产物形成最低（47 mM）。此外，在产物形成阶段添加FerT晶种虽不能阻止CTR初始下降，但可加速CTR恢复并将可溶性FerT浓度维持在0.4 mM以下。
**3.3 其他HCAAs的合成**
在验证了FerT生产后，研究人员将底物替换为CouA、iFerA和CafA，以评估该工艺的底物适用性。在5 mM/h供给速率和28 °C生产条件下，10小时后分别达到50.7 mM CouT（14.4 g/L，产率约100%）、46.5 mM iFerT（14.6 g/L，产率约93%）和9.7 mM CafT（2.9 g/L，产率约20%）。CouT和iFerT的生产耐受性良好，仅因底物耗尽而停止；然而CafA设置中CTR崩溃至4 mmol/h，仅在5小时后恢复且保持极低水平，表明CafT对生产宿主具有毒性。对照组中CTR在整个生产阶段保持稳定，证明重组酶表达本身不对宿主代谢造成负担。
**3.4 产物纯化与表征**
由于FerT在水中的溶解度极低，发酵过程中形成沉淀，大大简化了纯化过程。通过16–40 μm玻璃过滤器过滤发酵液，滤饼经2% HCl洗涤后，HPLC分析显示单一FerT峰，未检测到超过0.01%总峰面积的污染物。滤饼材料的质量平衡分析表明总纯度大于95%。重结晶后经NMR分析确认了产物身份，除重结晶所用溶剂外未检测到其他杂质。值得注意的是，仅0.44%的FerT存在于滤液中，表明绝大部分产物被有效截留。
**四、讨论与结论**
本研究成功开发了一种高效、稳健且可放大的生物技术工艺，用于在大肠杆菌中生产多种羟基肉桂酸-酪胺缀合物。研究的核心创新在于：(1) 采用双阶段工艺——将重组酶表达阶段（16 °C）与底物转化阶段（22–28 °C）解耦，有效平衡了酶的可溶性表达、稳定性和催化活性；(2) 利用目标产物的低溶解度特性实现原位沉淀，极大简化了下游处理过程；(3) 通过在线CTR监测实时反映细胞代谢状态，为工艺优化提供了直接依据。
研究揭示了底物供给速率与细胞代谢活力之间的密切关联。过高的供给速率导致可溶性产物过饱和，引起细胞毒性反应和CTR不可逆下降；而适中的供给速率允许细胞在短暂的适应期后恢复代谢活性。此外，产物种类对细胞毒性的差异（CafT > FerT ≈ CouT ≈ iFerT）暗示了儿茶酚结构可能增强毒性效应。
经济性分析表明，虽然目前HCAAs的化学合成成本极高（如FerT约�50,000/g，Sigma-Aldrich），但通过优化底物供应链（酪氨酸作为FerA和TyN的共同前体）和代谢工程改造（酪氨酸过量生产菌株），有望实现从廉价碳源到高附加值HCAAs的高效生物合成。本工艺中简单的过滤回收步骤相对于传统色谱纯化或液液萃取具有显著的经济和生态优势，为生物技术生产的羟基肉桂酸-酪胺类化合物的商业化应用奠定了基础。
