鼠李糖乳杆菌LRPerfectus158缓解小鼠感染后肠易激综合征并与下丘脑-垂体-肾上腺轴活性调节相关

《Food Frontiers》：Lacticaseibacillus rhamnosus LRPerfectus158 Alleviates Postinfectious Irritable Bowel Syndrome in Mice and Is Associated With Modulation of Hypothalamic–Pituitary–Adrenal Axis Activity

　　

肠易激综合征(IBS)是一种功能性胃肠疾病，以慢性低度炎症、内脏敏感性增高和肠道菌群组成紊乱为特征。本研究采用啮齿类柠檬酸杆菌感染联合水回避应激建立的IBS小鼠模型，研究了鼠李糖乳杆菌LRPerfectus158的缓解作用及其潜在机制。LRPerfectus158给药显著缓解了IBS样症状，包括降低粪便含水量、恢复结肠长度并减轻内脏超敏反应。行为学评估进一步表明，LRPerfectus158缓解了焦虑样行为。此外，LRPerfectus158给药降低了血清皮质酮水平，并伴随海马损伤减轻，提示其可能与下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活性改变相关。结肠组织学和分子分析显示，LRPerfectus158通过上调ZO-1和MUC2在mRNA和蛋白质水平的表达，减轻炎症、增加杯状细胞数量并增强上皮屏障完整性。转录组学分析进一步证实了LRPerfectus158在IBS中的双重作用，表明其能够缓解肠道神经超敏，同时抑制黏膜炎症并增强上皮屏障完整性。宏基因组测序显示，LRPerfectus158与肠道菌群组成改变相关，包括Muribaculum、Duncaniella、Bacteroides uniformis和Ligilactobacillus murinus等分类群相对丰度增加。综上，这些发现表明LRPerfectus158与IBS样症状的缓解相关，并与肠道菌群调节、肠道屏障增强和HPA轴过度激活减少相关联，凸显了其作为IBS干预潜在益生菌候选菌株的应用前景。

**论文解读：鼠李糖乳杆菌LRPerfectus158缓解感染后肠易激综合征的机制研究**

**研究背景与问题**
肠易激综合征(IBS)是一种常见的功能性胃肠疾病，以反复腹痛、排便习惯改变和内脏超敏为特征，严重影响患者生活质量并造成巨大社会经济负担。越来越多的证据表明，IBS的发病涉及肠-脑轴的双向调节失调，外周肠道紊乱与中枢神经系统高反应性协同促进疾病进展。其中，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的过度激活被认为是连接心理社会应激与肠道功能障碍的核心机制。升高的糖皮质激素水平会加剧上皮屏障破坏、黏膜炎症和神经敏化，从而加重IBS症状。因此，抑制HPA轴的过度激活已成为有前景的治疗策略。尽管目前药物选择有限，但累积证据表明肠道菌群是调节HPA活性和应激反应的关键因素。益生菌作为重塑肠道菌群组成的有效手段，已有多个菌株被报道可缓解IBS症状，但益生菌作用具有高度菌株特异性，因此需要针对能够调节HPA轴活性并缓解IBS症状的菌株进行机制性研究。鼠李糖乳杆菌LRPerfectus158分离自健康4月龄婴儿粪便，前期研究显示其具有强肠道定植能力、抗病原感染和抗炎作用，但其对IBS的缓解作用及机制尚不明确。本研究旨在利用感染后IBS小鼠模型，评估LRPerfectus158对IBS样症状的缓解作用，并探讨其与HPA轴活性、肠道菌群及肠屏障功能的关系。

**研究内容与结论**
研究人员采用啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)感染联合水回避应激(WAS)建立感染后肠易激综合征(PI-IBS)小鼠模型，该模型同时模拟外周肠道感染和中枢应激反应。实验将18只C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组和LRPerfectus158干预组，每组6只。实验为期30天，第1天模型组和干预组口服C. rodentium，随后干预组每日灌胃LRPerfectus158(1×10¹⁰ CFU/只)，第18-30天对所有小鼠进行WAS应激。实验期间评估体重、粪便含水量、结肠长度、内脏超敏反应(通过结直肠扩张和腹壁退缩反射评分)、焦虑样行为(旷场实验和高架十字迷宫)、海马组织学损伤、血清应激激素水平、结肠组织病理、杯状细胞数量、紧密连接蛋白和黏蛋白表达、结肠转录组及粪便宏基因组。研究结果表明，LRPerfectus158干预显著降低了IBS小鼠粪便含水量(从64.15%降至59.55%)，恢复结肠长度(从4.98 cm增至6.23 cm)，并显著降低腹壁退缩反射评分，表明内脏超敏得到缓解。行为学测试显示，LRPerfectus158显著减少了外周区活动距离、增加中央区停留时间，并延长高架十字迷宫开放臂停留时间，提示焦虑样行为减轻。海马Nissl染色显示，模型组海马CA1、CA3和DG区神经元数量显著减少，而LRPerfectus158干预恢复了神经元数量，同时海马DG区脑源性神经营养因子(BDNF)表达在干预后恢复至对照组的约84%。血清促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮水平在模型组显著升高，而LRPerfectus158干预显著降低了这两种激素水平，表明HPA轴过度激活受到抑制。结肠组织学分析显示，模型组出现明显炎症细胞浸润和隐窝深度减少，LRPerfectus158干预恢复了隐窝深度(达到对照组约94%)，并增加杯状细胞数量(每隐窝从11个增至20个)。分子水平上，LRPerfectus158干预上调了紧密连接蛋白ZO-1和黏蛋白MUC2的mRNA和蛋白表达。转录组分析显示，模型组与对照组间有1998个差异表达基因(DEGs)，而LRPerfectus158干预组与模型组间有3469个DEGs，KEGG富集分析显示这些基因富集于NF-κB信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号和MAPK信号等炎症免疫相关通路。具体而言，与内脏超敏相关的基因(如Htr2b、Slc6a17、Ngfr、Kcnq2、Chrna3、Chrnb4、Cacna1h)在模型组中上调，而LRPerfectus158干预后显著下调；血清素转运体基因Sert在模型组中下调，干预后上调。促炎基因Tnf、Mapk10、Ptger4在模型组中上调，干预后下调，而抗炎基因Adcy6和Il1rn在干预后上调。RT-qPCR验证了代表性基因的表达趋势与RNA-seq一致。宏基因组测序显示，LRPerfectus158干预改变了肠道菌群组成，β多样性分析显示干预组与模型组显著分离，物种水平上，干预组显著富集了Muribaculum intestinale、Duncaniella dubosii、Bacteroides uniformis和Ligilactobacillus murinus，同时降低了IBS相关的Helicobacter pullorum、Bacteroides faecium和Bacteroides thetaiotaomicron的丰度。KEGG功能注释提示脂肪酸代谢和叶酸生物合成通路可能发生改变。

**主要技术方法**
本研究使用了多种关键技术方法：动物模型构建采用C. rodentium感染联合水回避应激(WAS)建立PI-IBS小鼠模型；行为学评估采用旷场实验(OFT)和高架十字迷宫(EPM)；内脏敏感性通过结直肠扩张(CRD)和腹壁退缩反射(AWR)评分测定；组织学分析采用苏木精-伊红(H&E)染色和阿尔辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色；分子分析采用定量逆转录PCR(qRT-PCR)、Western blot和免疫荧光染色；海马损伤通过Nissl染色评估；转录组分析采用BGISEQ平台测序；宏基因组测序采用MGISEQ-2000平台。样本来源：LRPerfectus158分离自中国广东省中山市一名健康4月龄婴儿粪便，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

**研究结果**
**3.1 LRPerfectus158缓解IBS相关肠道症状**：与对照组相比，模型组粪便含水量显著增加至64.15%±3.38%，结肠长度缩短至平均4.98 cm，AWR评分在0.1、0.2、0.3 mL扩张体积下显著升高。LRPerfectus158干预使粪便含水量降至59.55%±2.98%，结肠长度恢复至6.23 cm，AWR评分显著降低，表明内脏超敏减轻。

**3.2 LRPerfectus158缓解IBS相关焦虑样行为**：旷场实验中，模型组外周区活动距离显著增加(8378.49 mm vs 6761.01 mm)，中央区停留时间减少(9.95% vs 14.89%)，LRPerfectus158干预显著逆转了这些指标。高架十字迷宫测试中，模型组开放臂停留时间减少(24.96 s vs 42.08 s)，干预后增至62.40 s。海马Nissl染色显示模型组CA1、CA3和DG区神经元数量减少，干预后恢复。免疫荧光显示模型组海马DG区BDNF表达降低，干预后恢复至对照组的84%。血清ACTH和皮质酮在模型组升高，干预后显著降低。

**3.3 LRPerfectus158改善IBS下的肠屏障**：H&E染色显示模型组炎症细胞浸润明显，隐窝深度从对照组的365.94 μm降至213.97 μm，干预后恢复至约94%。ZO-1 mRNA和蛋白表达在模型组下调，干预后分别上调2.72倍和显著增加。AB-PAS染色显示模型组每隐窝杯状细胞数从对照组约20个降至11个，干预后增至20个。MUC2 mRNA在模型组下调，干预后上调1.59倍；免疫荧光证实MUC2表达在干预后恢复。

**3.4 LRPerfectus158抑制IBS相关超敏和炎症基因表达**：转录组PCA显示三组明显分离。模型组与对照组比较有1998个DEGs(1322上调，676下调)，Lr158组与模型组比较有3469个DEGs(2376下调，1093上调)。KEGG富集分析显示炎症和免疫相关通路显著富集。内脏超敏相关基因(Htr2b、Slc6a17、Ngfr、Kcnq2、Chrna3、Chrnb4、Cacna1h)在模型组上调，干预后下调；Sert在模型组下调，干预后上调。促炎基因Tnf、Mapk10、Ptger4在干预后下调，抗炎基因Adcy6、Il1rn上调。RT-qPCR验证了Htr2b、Sert和Tnf的表达趋势与RNA-seq一致。

**3.5 LRPerfectus158改善IBS小鼠肠道菌群失调**：α多样性(Chao1指数)在三组间无显著差异，但β多样性(PCA和PCoA)显示三组明显分离，PERMANOVA分析确认组间差异显著(p=0.008，R2=0.18)。属水平上，模型组Ligilactobacillus相对丰度显著降低(1.39%→0.23%)，LRPerfectus158干预后显著增加(0.23%→1.14%)；Muribaculum在干预后显著增加(4.16%→7.96%)。物种水平上，干预组显著富集M. intestinale、D. dubosii、B. uniformis和L. murinus，降低H. pullorum、B. faecium和B. thetaiotaomicron。KEGG功能注释提示脂肪酸代谢和叶酸生物合成通路改变。

**讨论与结论**
讨论部分指出，IBS是肠-脑轴双向调节失调的疾病，HPA轴过度激活与应激相关。LRPerfectus158通过抑制HPA轴过度激活、调节肠道菌群、增强肠屏障和减轻炎症来缓解IBS症状。转录组分析显示其同时调节神经递质信号(如5-HT系统)和炎症基因网络。菌群改变可能通过产生短链脂肪酸等代谢物影响神经免疫通路。研究存在局限性，包括未设置单独感染或单独应激对照组、仅评估单一剂量、组学样本量较小、未直接测量代谢产物。结论部分总结：LRPerfectus158缓解了小鼠IBS样症状，包括减少内脏超敏和焦虑样行为，改善肠屏障完整性，调节肠道菌群组成，提示其可作为IBS干预的辅助益生菌候选菌株，但需进一步进行剂量反应、代谢组学和功能验证研究。

该研究发表在《Food Frontiers》期刊上，研究得到了国家重点研发计划(No. 2022YFF1100100)资助。