遗传密码的自动化原型设计

《Nature》：Automated prototyping of genetic codes

　　

标准遗传密码使用64个密码子在生命各个结构域中编码20种规范氨基酸。自然界中不存在的遗传密码能够实现新的化学反应、治疗方法和生态系统工程，但对生物体基因组进行重编码极具挑战性。研究人员在此描述了用于在无细胞翻译系统中进行遗传密码多重机器人原型设计的自动化遗传tRNA扩展（AGENTEX）。核糖体大亚基（LSU）中的两个Watson-Crick相互作用介导了对tRNA 3^′ CCA末端的识别，从而阻止具有替代性3^′序列的tRNA在翻译过程中被接纳。基于这些相互作用，研究人员调查了非CCA-3^′ tRNA（otRNAs）在多大程度上能被天然的氨酰tRNA合成酶氨基酰化，从而允许使用带有改变LSU的核糖体的otRNA库来指定独特的遗传密码。研究人员开发了多重且自动化的方法来读取合成tRNA文库中的氨基酰化。研究人员发现，tRNA的3^′末端对突变表现出显著的灵活性，允许所有大肠杆菌aaRSs对大多数otRNAs进行氨基酰化。基于这一发现，研究人员开发了无细胞翻译系统，该系统能够实现34种aaRSs对应34个密码子的压缩遗传密码。使用AGENTEX，研究人员评估了两种遗传密码以及标准遗传密码，实现了非标准氨基酸的掺入以及多达三个密码子的重新分配。研究人员的发现对于设计全新的翻译系统、合成包含多个非标准单体的生物聚合物，以及理解过去和未来可能的遗传密码具有重要意义。

【研究背景与意义】
标准遗传密码使用64个密码子编码20种规范氨基酸。合成遗传密码赋予了生物体新的特性，如增强的抗病毒能力和降低的水平基因转移，并能够生产基因编码材料、治疗药物和生物催化剂。尽管遗传密码扩展已经允许在活细胞内将400多种非标准氨基酸引入蛋白质，但在整个基因组范围内重新分配多个有意义密码子，以及将多个非标准氨基酸高纯度地掺入多肽中仍然面临巨大挑战。为了实现对从基因序列空间到序列定义化学的完全控制，需要对翻译系统进行更为根本性的重新设计。由于基因组合成和编辑极具挑战性，研究人员开发了一种完全自动化的工作流程来设计和测试新的遗传密码，以加速基因组工程并实现对序列定义聚合物合成的空前控制。这项研究成果发表在《Nature》上。研究人员开发了名为自动化遗传tRNA扩展（AGENTEX）的技术，用于在无细胞翻译系统中进行遗传密码的多重机器人原型设计。该研究证明了带有非CCA 3^′末端的tRNA（otRNAs，正交tRNA）能被天然氨酰tRNA合成酶广泛氨基酰化，且野生型（WT，野生型）核糖体可作为过滤器阻止这些otRNAs的非特异性翻译。最终，研究人员成功在无细胞系统中并行运行压缩遗传密码与标准遗传密码，为构建具有完全不同特性的生物体和合成非标准单体生物聚合物奠定了基础。

【关键技术方法】
研究人员主要使用了以下关键技术方法：首先，开发了名为基于自动化NGS的氨基酰化测序（tSCAN）的自动化多重测量方法，结合高通量测序（NGS）和磁珠纯化技术，在无细胞翻译系统中定量测定合成tRNA文库的氨基酰化水平。其次，开发了tSCAN-M技术，利用同位素标记的tRNA结合液相色谱-质谱（LC-MS），直接鉴定tRNA携带的氨基酸种类。第三，利用Opentrons OT-2机器人平台实现从DNA构建、tRNA体外转录到多肽纯化的全自动化操作。最后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和高灵敏度发光报告系统评估多肽翻译效率和遗传密码重分配效果。样本序列来源主要为大肠杆菌天然同工tRNA以及M. alvus和M. mazei物种的tRNA。

【研究结果】
tSCAN的开发与优化
为了解决非自然架构tRNA在活细胞内成熟困难且无法多重测量其氨基酰化的问题，研究人员开发了tSCAN方法。该方法利用基于裂解液的无细胞翻译系统，通过高碘酸盐氧化和β-消除反应区分已氨基酰化和未氨基酰化的tRNA，并在Opentrons OT-2机器人上实现了自动化纯化流程。通过测试M. alvus和M. mazei的tRNA，研究人员验证了tSCAN能够有效量化tRNA氨基酰化并识别正交tRNA。

所有aaRSs均能对非CCA末端tRNA进行氨基酰化
研究人员利用tSCAN测试了3^′末端第二条碱基发生简并（CNA）的大肠杆菌tRNA文库。研究发现在裂解液系统中，大肠杆菌aaRSs能够对大多数非CCA末端的tRNA进行氨基酰化，其中CGA末端的氨基酰化水平最高。而在PURExpress系统（PURE，一种由纯化组分构成的无细胞翻译系统）中，由于缺乏tRNA修饰，氨基酰化水平显著降低，表明完整的细胞环境对于非CCA末端tRNA的氨基酰化至关重要。

tRNA修饰对氨基酰化的影响
研究人员对比了裂解液和PURE系统中的氨基酰化差异，提出裂解液中存在的天然tRNA修饰影响了tRNA与aaRSs的相互作用。研究发现，由II类aaRSs氨基酰化的tRNA通常表现出较低的氨基酰化水平，但在裂解液中，某些tRNA（如丝氨酸和苏氨酸tRNA）在将CCA末端改为CGA、CUA或CAA时，氨基酰化反而增加。结构建模表明这可能与空间位阻差异有关。

受体茎氨基酰化图谱
研究人员进一步探究了tRNA末端倒数第二和倒数第三位碱基（74和75位）的多样性对氨基酰化的影响。通过构建包含所有大肠杆菌同工tRNA序列的文库并进行tSCAN分析，发现许多位点对替换具有宽容性。某些tRNA（如valT、pheV）对替换表现出极大的灵活性。此外，GCA末端在约60%的tRNA中表现出氨基酰化减少，这与核糖体对GCA末端的低效接纳可能形成翻译调控机制有关。

核糖体阻止翻译串扰
鉴于aaRSs能够广泛氨基酰化非CCA末端tRNA，研究人员测试了WT核糖体是否会接纳这些otRNAs。通过设计丙氨酸和丝氨酸反密码子互换的压缩遗传密码（MP1），并利用LC-MS/MS检测报告多肽，研究人员发现在含有或不含MP1的翻译系统中，WT核糖体仅能产生标准遗传密码的多肽。这表明WT核糖体作为过滤器，阻止了otRNAs的非特异性掺入，防止了与天然翻译系统的串扰。

利用AGENTEX构建压缩遗传密码
研究人员部署了AGENTEX系统，测试了包含22个密码子的压缩遗传密码（MP2 tRNA库）。通过引入含有G2251C和G2553C突变的核糖体大亚基（LSU，核糖体大亚基）的CGA核糖体，以及能够解码UAG密码子的M. jannaschii tRNATyrCUA，研究人员在无细胞系统中成功翻译了含有非标准氨基酸的多肽。发光报告系统和LC-MS/MS分析证实，CGA核糖体能特异性接纳otRNAs并高效翻译多肽，且未检测到与标准遗传密码的串扰。

【讨论与结论】
研究人员开发并展示了AGENTEX在测试多种遗传密码中的能力，实现了无交叉串扰的并行翻译。研究发现，尽管CCA序列在tRNA功能中至关重要，但它对突变表现出显著的灵活性。全面的细胞环境对大多数具有不同3^′末端的tRNA的氨基酰化是必需的，这反映了tRNA修饰的必要性。研究修正了将翻译系统视为从基因组到蛋白质组的线性进程的观点，表明遗传密码是由翻译机器主动维持的多层系统。虽然aaRSs可以氨基酰化带有变异3^′ CCA序列的tRNA，但核糖体作为主要过滤器阻止了它们的非特异性翻译。基于这些发现，研究人员成功测试了将标准遗传密码压缩为由22个tRNA指定的遗传密码，并翻译了含有非标准氨基酸和三个重分配密码子的多肽。这一工作为构建具有完全不同特性的生物体和合成非标准单体生物聚合物奠定了基础，并且该无细胞技术确保了生物安全，能够快速且安全地测试高度分化的遗传密码。