《Nature Methods》：All-optical multimodal mapping of single-cell-type-specific metabolic activities via REDCAT
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代谢是细胞功能的基础，但其活动在组织环境中存在差异。以单细胞分辨率原位解析这些过程对于理解健康和疾病中的生理学至关重要。然而，现有方法缺乏生化特异性或与细胞身份的直接联系。研究人员在此报告了一种方法——拉曼增强组织细胞图谱描绘（Raman Enhanced D
代谢是细胞功能的基础，但其活动在组织环境中存在差异。以单细胞分辨率原位解析这些过程对于理解健康和疾病中的生理学至关重要。然而，现有方法缺乏生化特异性或与细胞身份的直接联系。研究人员在此报告了一种方法——拉曼增强组织细胞图谱描绘（Raman Enhanced Delineation of Cell Atlases in Tissues, REDCAT），这是一个整合了拉曼散射显微镜（Raman scattering microscopy）和高多重免疫荧光（high-plex immunofluorescence）的全光学平台，用于共同映射代谢和细胞类型。REDCAT实现了人类组织中蛋白质、脂质、核代谢物和氧化还原代谢的亚细胞水平分析。在淋巴结中，它揭示了细胞类型特异性的代谢特化。在淋巴瘤中，REDCAT发现了肿瘤转化过程中的深刻重编程和过渡状态。在肝脏中，它解析了依赖于区域（zonation-dependent）的代谢梯度。通过将细胞身份与空间代谢状态联系起来，REDCAT为研究免疫和癌症提供了一个框架，为解读疾病的代谢基础开辟了路径。
**论文解读：REDCAT——全光学多模态单细胞类型特异性代谢活动映射平台**
**研究背景与科学问题**
代谢是细胞功能的基础，涵盖能量产生、生物分子合成和氧化还原平衡维持等过程，受内在程序和组织微环境信号动态调控。在健康和疾病（如免疫应答和癌症）中，代谢活动的空间异质性和细胞类型特异性至关重要。然而，现有方法在直接原位测量代谢活性方面存在局限：空间组学技术（如转录组或蛋白质组推断）无法直接报告动态代谢状态，质谱成像（MSI）虽能映射分子分布，但通常具有破坏性，且空间分辨率与分子覆盖度之间存在权衡，难以在同一组织切片上进行纵向研究和多模态测量，导致代谢测量与细胞身份链接的保真度降低。拉曼成像虽能无标记化学成像，但自发信号弱，而受激拉曼散射（SRS）可增强信号并提供定量对比。因此，亟需一种能够同时解析代谢特征和细胞身份的高分辨率、非破坏性方法。
**研究内容与意义**
研究人员开发了REDCAT（Raman Enhanced Delineation of Cell Atlases in Tissues），一种整合SRS代谢成像、双光子激发荧光（TPEF）、二次谐波产生（SHG）和高多重免疫荧光（通过CODEX实现）的多模态平台。该平台基于MaxFuse算法对齐模态并链接单细胞蛋白标记与代谢特征，实现亚微米级分辨率测量蛋白质、脂质、核特征和氧化还原状态。REDCAT兼容新鲜冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床标本。研究人员将其应用于正常和恶性人类淋巴组织及正常人类肝脏，揭示了细胞类型特异性代谢程序、肿瘤相关代谢重编程以及从中央静脉到门静脉的依赖区域（zonation-dependent）代谢梯度。该研究发表于《Nature Methods》。
**关键技术方法**
REDCAT的工作流程如下：首先，对约10微米厚的FFPE或新鲜冷冻组织切片进行TPEF–SRS-SHG成像，获取无标记代谢特征（NADH/FAD氧化还原比、蛋白质/脂质比、不饱和/饱和脂质比、胶原分布等），并通过高光谱SRS（2700–3150 cm
?1，51通道）获取详细化学谱。随后，同一切片进行约50重CODEX免疫荧光成像，最后进行H&E染色。通过仿射配准对齐图像，经Mesmer分割后提取单细胞特征，利用MaxFuse在不同模态间匹配细胞，实现蛋白质定义的细胞类型与代谢特征的单细胞对应。样本来源：人类淋巴组织样本由耶鲁病理组织服务处（YPTS）提供，经机构审查委员会（IRB）批准；正常淋巴结来自一名体重指数为32的个体，肿瘤组织来自一名体重指数为37的个体；新鲜冷冻正常肝脏组织来自耶鲁大学。
**研究结果**
**REDCAT的设计与工作流程**
REDCAT流程总结于图1。通过TPEF–SRS-SHG平台获取无标记代谢特征，随后进行CODEX多重免疫荧光和H&E染色。图像通过仿射配准对齐，单细胞特征经MaxFuse整合，以细胞对细胞（cell-by-cell）方式链接蛋白质定义的细胞类型与代谢特征。
**REDCAT映射健康人类淋巴结中的细胞类型特异性代谢活动**
研究人员将REDCAT应用于健康供体的FFPE淋巴结切片（1.6 mm × 1.6 mm ROI）。通过TPEF–SRS成像获取NADH、FAD、蛋白质和脂质信号，随后用48种蛋白标记的CODEX成像。细胞分割和聚类后识别出9个细胞簇，对应已知组织学结构。定量分析显示，大多数簇中不饱和/饱和脂质比与NADH/FAD比正相关，而脂质/蛋白质比与NADH/FAD或不饱和/饱和脂质比负相关。生发中心明区（簇4）的B细胞比暗区（簇3）具有更高的NADH/FAD氧化还原比和不饱和/饱和脂质比，表明代谢状态与细胞活化状态相关。通过MaxFuse整合CODEX与scRNA-seq数据，进一步注释细胞亚型，并在UMAP中显示代谢特征广泛分布，表明细胞身份不完全决定代谢表型，空间定位和活化状态也影响代谢重编程。
**REDCAT揭示人类淋巴瘤中的代谢重编程**
研究人员用REDCAT分析了包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的Richter转化淋巴瘤样本。CODEX聚类识别出12个细胞簇，DLBCL细胞（簇11）高表达CD20、PD-L1和Ki67。代谢分析显示，肿瘤组织脂质水平、不饱和脂质和NADH/FAD氧化还原比升高，表明肿瘤微环境中脂质代谢和氧化还原活性增强。通过整合代谢特征和蛋白质表达谱，UMAP识别出三个不同肿瘤细胞簇：簇1（CLL细胞）具有高不饱和/饱和脂质比，簇3（DLBCL细胞）具有较低不饱和脂质比但高脂质/蛋白质比，簇2呈过渡状态。空间映射显示CLL细胞脂质积累显著，DLBCL细胞脂质信号弥散，NADH/FAD比更高。空间邻域分析显示淋巴瘤中免疫细胞空间组织被破坏，正常免疫微环境部分被肿瘤相关微环境取代。
**REDCAT解析淋巴瘤转化过程中细胞类型特异性化学谱的变化**
高光谱SRS成像（HSI）结合35重CODEX分析CLL至DLBCL转化过程中的代谢谱。k-means聚类识别出8个化学簇，肿瘤组织富集脂质相关簇（4、6、8）。整合HSI与CODEX细胞注释，发现脂质重塑广泛存在于多种细胞类型中。CD20+中间细胞（CLL与DLBCL之间）的SRS谱与CLL和DLBCL细胞不同，支持存在过渡状态（肿瘤簇2）。T细胞在三个区域（CLL、中间、DLBCL）表现出不同的化学谱，靠近CLL细胞的T细胞脂质积累显著，表明肿瘤诱导的代谢重塑扩展至恶性B细胞之外的免疫细胞。正常淋巴结中CD68+巨噬细胞脂质水平高、氧化还原比低，而在淋巴瘤中这些特征被破坏。
**超分辨REDCAT揭示淋巴瘤中亚细胞脂质多样性和核异质性**
通过细胞质分割和A-PoD超分辨处理，发现CLL细胞具有大脂滴簇，DLBCL细胞具有较小脂滴，且脂质信号富集于核仁和核膜。核代谢谱分析显示，淋巴瘤细胞核比正常淋巴结细胞核具有更高的代谢异质性（超过80%的淋巴瘤细胞核含有≥3个簇，而正常仅约20%）。不同细胞类型的核SRS谱在淋巴瘤中发生重塑，表明恶性转化中核代谢发生深刻改变。
**REDCAT揭示淋巴瘤中胶原纤维结构紊乱和组成改变**
通过SHG和CODEX成像，发现淋巴瘤中胶原纤维密度降低、纤维更细更短、弯曲度更高、取向更分散，且SRS谱显示胶原组成和分子堆积发生变化，表明淋巴瘤伴随细胞外基质重塑。
**REDCAT映射人类肝脏中亚细胞代谢活动**
研究人员将REDCAT应用于新鲜冷冻正常人类肝脏切片（1.6 mm × 1.6 mm ROI，包含中央静脉和门静脉）。CODEX聚类识别出13个簇，与肝小叶分区（zone 1/2/3）对应。TPEF–SRS显示脂滴（LD）和NADH/FAD比在三个区域中分布不均，zone 2 LD面积最大。LD不仅存在于肝细胞，还存在于CD141+、CD45+和CD68+细胞中。高光谱SRS显示不同细胞类型LD具有不同谱特征，且肝细胞SRS谱随空间位置变化。核代谢谱分析显示，近中央静脉区域存在距离依赖性谱变化，定量表明2883 cm
?1/2960 cm
?1比值从中央静脉向外递增，而门静脉区无此现象。
**总结与讨论**
REDCAT作为整合SRS化学成像和CODEX免疫荧光成像的多模态光学平台，能够在单细胞水平分析蛋白质组和代谢谱，适用于FFPE和新鲜冷冻组织。在FFPE淋巴结和淋巴瘤中，REDCAT监测免疫细胞活化过程中的代谢重编程，并识别肿瘤发展中的亚细胞代谢特征。数据表明FFPE组织中脂质物种得以保存，为临床组织病理学研究提供潜力。在正常淋巴结中，脂质水平与NADH/FAD比呈负相关，暗示脂质含量和氧化还原状态可指示免疫细胞代谢稳态；但在淋巴瘤中这种相关性被破坏。CLL和DLBCL细胞中脂质水平、氧化还原比和核异质性上调，表明广泛代谢重塑。CLL中脂滴积累可能与CD36表达和自噬有关，但脂质代谢途径需进一步验证。研究人员还发现CLL至DLBCL转化涉及脂质分布重塑，包括核和膜脂质。DLBCL细胞核仁中检测到脂质积累，可能参与信号传导和基因表达调控。正常巨噬细胞中脂质反映活跃免疫监视，而淋巴瘤浸润巨噬细胞中脂质减少，提示功能失调。在新鲜冷冻肝脏中，观察到依赖于细胞类型和空间区域的脂滴多样性及核化学性质距离依赖性变化。REDCAT仍面临代谢物注释和覆盖度挑战，可通过指纹区高光谱采集、扩充参考库和生成式AI数据分析解决。其优势在于通过高分辨率代谢特征识别组织学模式，并可与其他空间技术整合。总之，REDCAT提供了一种高空间分辨率、单细胞类型特异性的无标记代谢分析流程，适应多种生物样本，能够揭示常规检测难以察觉的细微代谢改变。随着SRS分辨率、光谱覆盖和代谢物注释的进步，REDCAT将实现更详细的单细胞或亚细胞空间代谢组学映射，为生物过程提供更深入的功能和机制见解。
