《Foods》：Production of Recombinant Hemoglobin in Tremella fuciformis Yeast-like Cells Through Selection of Hemoglobins and Secretion Elements
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血红蛋白因在替代蛋白食品与食品生物技术中的潜在应用而受到关注，但利用真菌酵母样细胞生产重组血红蛋白仍鲜有探索。本研究以银耳（Tremella fuciformis）酵母样细胞（YLCs）为候选宿主，通过筛选候选血红蛋白与分泌元件进行评估。研究人员将截叶苜蓿（T
血红蛋白因在替代蛋白食品与食品生物技术中的潜在应用而受到关注，但利用真菌酵母样细胞生产重组血红蛋白仍鲜有探索。本研究以银耳（Tremella fuciformis）酵母样细胞（YLCs）为候选宿主，通过筛选候选血红蛋白与分泌元件进行评估。研究人员将截叶苜蓿（Trifolium subterraneum）截叶苜蓿血红蛋白（CHb）、透明颤菌（Vitreoscilla）血红蛋白（VHb）及豇豆（Vigna unguiculata）豆血红蛋白2（Lb2）在银耳YLCs中异源表达，估算产量分别为32.00、19.03与23.51 mg/L，其中CHb产量最高。随后以CHb考察CysR信号肽、α-交配因子前原导肽（Amf）与糖化酶信号肽（Gla）的介导分泌效果；三者均可介导分泌，Amf胞外CHb产量达106.43 mg/L、总产量133.02 mg/L，约为无分泌元件组的4.16倍，CysR与Gla胞外产量分别为72.54与49.50 mg/L。结果表明CHb与Amf是银耳YLCs中较优组合，但在食品应用前仍需直接表征血红素掺入与功能性质。
研究背景与立项依据
血红蛋白为含血红素球蛋白，近年因替代蛋白食品、营养强化及呈色呈味潜力受关注。银耳为食药两用真菌，其酵母样细胞（YLCs）呈单细胞、适液体发酵且具真核翻译后修饰能力，是食品重组蛋白潜在平台，但既往研究多聚焦产物本身，对适宜靶蛋白与高效分泌策略探索有限。透明颤菌血红蛋白（VHb）已有银耳表达报道，植物源血红蛋白因肉类替代与强化潜力受重视，截叶苜蓿血红蛋白（CHb）具良好颜色稳定性。分泌表达利于下游回收，信号肽决定内质网（ER）靶向与分泌效率，而银耳YLCs中分泌元件比较研究稀缺。因此研究人员在同源宿主背景下并行比较候选血红蛋白与分泌元件，从靶蛋白与分泌策略两层评估重组血红蛋白生产。
主要技术方法概述
研究人员以华中农业大学保藏的银耳YLCs菌株32Y为宿主，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105介导转化将表达盒整合入基因组；候选基因chb、vgb、lb2按银耳偏好密码子优化合成，由银耳甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（Ygpd）驱动，C端融合6×His标签；分泌组将CysR（银耳预测半胱氨酸富集分泌蛋白信号肽）、酿酒酵母α-交配因子前原导肽（Amf）、黑曲霉糖化酶信号肽（Gla）与chb融合。培养补加5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（ALA）以支持血红素合成。检测端采用RT-qPCR看家基因β-tubulin归一化转录丰度，SDS-PAGE结合BCA定量与ImageJ条带灰度估算胞内/胞外蛋白产量，以eGFP/潮霉素抗性融合标记筛选稳定转化子。
研究结果
3.1 表达载体构建与验证：PCR与测序确认Ygpd及三血红蛋白基因、三分泌融合盒正确装入双元载体pGEH，农杆菌转化后基因组PCR与eGFP荧光证实稳定整合。
3.3 候选血红蛋白表达筛选：RT-qPCR检出三基因转录；SDS-PAGE约15 kDa处见目标带；产量估算CHb 32.00 mg/L > Lb2 23.51 mg/L > VHb 19.03 mg/L，选CHb进分泌筛选。
3.4 分泌元件对CHb产量与分泌影响：CysR-CHb的ΔCt（Ct(chb)?Ct(β-tubulin)）显著高于Amf/Gla，提示稳态转录低，但总产与胞外比并非单纯随转录量变化。SDS-PAGE示Amf胞外带最强。定量上Amf总产133.02 mg/L（胞外106.43 mg/L，占比80.0%）、CysR总产117.55 mg/L（胞外72.54 mg/L）、Gla总产70.33 mg/L（胞外49.50 mg/L）；无分泌元件CHb仅胞内32.00 mg/L。Amf总产约为无元件组4.16倍，为三者最优。
讨论部分总结
不同球蛋白同启动子同密码子优化下产量仍分化，印证靶蛋白需实验筛选；产量估值为球蛋白量而非全血红素血红蛋白量，因未直接测血红素掺入，ALA补加仅支持前体供应。分泌元件致5′编码上下文差异可部分解释转录丰度不同，但蛋白产量还受翻译、稳定性、ER转运与分泌影响，mRNA-蛋白相关性弱。Amf含pre+pro区，pro区经N-连接糖基化、Kar2/BiP协同易位与质量调控促分泌，解释其优于仅含信号肽的CysR/Gla；CysR虽转录低却分泌不弱，作银耳内源信号肽有潜力。相较毕赤酵母（Pichia pastoris）LegH可达g/L级、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌大豆血红蛋白数百mg/L，本研究银耳胞外CHb达100 mg/L级属可行基线，非上限；后续可从启动子、HEM基因、发酵放大与下游回收推进。银耳兼具酵母态培养与真核修饰，但工具箱与放大鲁棒性待建。
结论译文
本研究评估银耳YLCs作重组血红蛋白宿主。三候选中CHb估算产量最高，选作分泌筛选靶标；三分泌元件均介导分泌，Amf总体最优，胞外106.43 mg/L、总133.02 mg/L。CHb与Amf为银耳YLCs中适宜组合，支撑该平台用于食品相关重组蛋白生产，但食品适用前须直接表征重组CHb血红素掺入与功能性质。
