《Foods》：Comparative Metabolomic Analysis Reveals the Varied Accumulations of Functional Nutrients in Differentially Pigmented Mung Bean Seeds
种皮颜色与绿豆（Vigna radiata L.）种子的营养和功能特性密切相关。然而，种皮颜色与绿豆种子营养物质效率之间的关系尚未被明确阐明。本研究对四种具有不同种皮颜色的品种（黑色：BL，黄色：YE，黄绿色：YG，绿色：GR）进行了比较代谢组学分析、生物活性化合物含量测定和抗氧化能力（ABTS+、DPPH、FRAP）评估。在这些绿豆种子中共鉴定出1544种代谢物，其中氨基酸及其衍生物、黄酮类化合物、酚酸、脂质和萜类化合物是相对信号丰度最高的五大类。BL富含黄酮类化合物（20.12%）、黄酮醇、花青素（其中6种花青素的含量是其他品种的22.32–565.21倍）、游离脂肪酸和酚酸。YE积累了更多的氨基酸及其衍生物（31.85%）、异黄酮（其中大豆苷元含量是其他品种的1.97–9.34倍）、黄酮和木脂素/香豆素。抗氧化能力测定结果显示，BL表现出最强的FRAP（p < 0.05），YG具有最高的DPPH清除活性（p < 0.05），而YE在数值上显示出最高的ABTS+清除能力（p > 0.05）。值得注意的是，花青素积累与FRAP呈正相关，而异黄酮和氨基酸积累与ABTS+清除能力呈正相关。这些发现表明，绿豆种子的整体抗氧化活性是由多种代谢物类别共同调控的。本研究阐明了绿豆品种间的种子代谢组变异，为功能育种和精准食品开发提供了见解。
绿豆（Vigna radiata L.）作为一种重要的食用豆类，是一种高蛋白低脂肪作物，兼具药用和食用价值。它在亚洲、非洲、南美洲和澳大利亚的种植面积超过六百万公顷[1,2,3]，全球年产量超过三百万吨。绿豆种子营养均衡，是蛋白质、膳食纤维、维生素和氨基酸的优良来源[1]。此外，它们还含有多种生物活性化合物，包括多酚、黄酮类化合物、矿物质、多糖和多肽[4,5]，这些成分赋予了绿豆超越基础营养的功能特性。近几十年来，这些营养物质和生物活性化合物已被确定与多种健康益处密切相关[6,7]，包括护肝和降压[8,9,10]、降血糖和降血脂作用及解毒[11,12,13]、抗癌[4,7,14]、抗黑色素生成[15]、缓解热应激[16]和免疫调节活性[17]，使绿豆成为一种流行的功能食品。
种皮颜色是绿豆中视觉上最具特色且在农艺上最重要的性状之一，直接影响消费者的偏好、市场价值和营养品质。在中国，消费者最熟悉的是绿色种皮的绿豆，广泛用于传统汤品、甜点和芽苗菜产品。相比之下，黄色绿豆主要在菲律宾和印度消费，在这些地方，它们被优先用于特定的烹饪应用，如制作豆糊（dhal）。绿豆还有其他种皮颜色，包括黑色、棕色和斑点图案[18]，每种颜色都与特定的遗传背景和适应性特征相关。值得注意的是，有色种子，特别是黑色和红色品种，通常比无色品种表现出更高的抗氧化活性[19]，这主要是由于花青素和其他酚类化合物在种皮中的积累。研究表明，不同颜色的绿豆之间营养物质和生物活性化合物组成存在显著差异，表明颜色表型可以作为功能品质的可靠指标。例如，黑绿豆的总酚酸含量和抗氧化活性显著高于传统绿色品种[11]。然而，不同颜色绿豆之间的代谢谱差异仍需系统表征，特别是关于这些变异背后的特定代谢物类别和代谢途径。
代谢组学已成为全面表征植物代谢表型的强大方法，能够同时检测和定量数百至数千种代谢物。在可用的分析平台中，超高效液相色谱联用三重四极杆质谱（UHPLC-QqQ-MS）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）为代谢组学研究提供了无与伦比的优势，包括在单次分析运行中检测和定量多种代谢物类别（如氨基酸、脂质、有机酸和多酚）的高灵敏度、分辨率和通量。这些技术已广泛应用于各种作物和水果的植物代谢物分析[20,21]，以及绿豆胁迫响应、萌发过程和品质形成的研究[16,22,23]。然而，专门针对不同颜色绿豆品种的比较代谢组学研究仍然有限[23]，这在理解种皮颜色形成的代谢基础及其功能意义方面构成了显著的知识空白。
随着消费者对针对特定健康需求的功能食品需求日益增长——例如用于预防慢性病的富含抗氧化剂的产品或用于营养强化的高蛋白品种——阐明不同颜色绿豆的代谢特征已成为指导定向育种计划和优化资源利用的关键。本研究将广泛靶向代谢组学与全面的生理生化分析相结合，系统鉴定了四种具有不同种皮颜色（黑色：BL，黄色：YE，黄绿色：YG，绿色：GR）的绿豆品种的特征代谢物，阐明了关键代谢途径，并建立了它们与抗氧化活性的相关性。利用基于UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学，结合生物活性化合物（包括叶绿素、类胡萝卜素、总黄酮、总酚和花青素）的定量和抗氧化能力测定（2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）和2,2′-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS+）清除能力，以及铁离子还原抗氧化能力（FRAP）），我们研究了种子颜色、代谢组组成和抗氧化活性之间的关联。这些发现不仅将揭示绿豆种皮颜色形成的代谢基础，还将为开发功能性绿豆产品提供基础。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
‘黑珍珠’（黑籽，BL）、‘中绿16号’（黄籽，YE）、‘并绿22号’（黄绿籽，YG）和‘晋绿8号’（绿籽，GR）的种子表现出明显的种皮色素沉着表型（图1），于2022年8月从山西农业大学东阳实验基地收获，该基地位于中国山西省晋中市榆次区（112°40′51″ E，37°33′05″ N）。黑籽品种BL具有深色且均匀的种皮，YE呈现亮黄色种皮，YG表现出黄绿色过渡种皮颜色，GR则显示出典型的绿色种皮表型。BL、YG和GR是山西农业大学（中国山西）培育的优质绿豆品种，而YE来自中国农业科学院作物科学研究所（中国北京）。
图1. 四种具有不同种皮颜色的绿豆品种的种子形态。BL：黑籽品种‘黑珍珠’；YE：黄籽品种‘中绿16号’；YG：黄绿籽品种‘并绿22号’；GR：绿籽品种‘晋绿8号’。
2.2. 种子颜色参数测定
使用CR8色差计（3nh，广州，中国）对四个绿豆品种的种子进行颜色参数测量，重复十次[24]。
2.3. 代谢物提取与代谢组学分析
绿豆种子在冻干机（Scientz-100F，宁波新芝生物科技股份有限公司，宁波，中国）中冻干，并使用研磨机（MM 400，Retsch GmbH，哈恩，德国）研磨成细粉。随后，将50 mg粉末用1200 μL预冷（?20 °C）的含内标的70%甲醇水溶液提取。混合物涡旋30秒，每30分钟重复一次，共六次循环，然后在4 °C下以12,000 rpm离心3分钟。收集所得上清液，通过0.22 μm微孔滤膜过滤，并转入进样瓶中进行UPLC-MS/MS分析[25]。基于UPLC-MS/MS的广泛靶向代谢组学测序是一种相对定量方法。获得的峰面积反映代谢物的相对丰度。
2.4. 差异积累代谢物（DAMs）的鉴定与富集分析
使用KEGG COMPOUND数据库（http://www.kegg.jp/kegg/compound/，访问日期：2023年3月10日）对检测到的代谢物进行注释，随后映射到KEGG PATHWAY数据库（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html，访问日期：2023年3月10日）。使用变量投影重要性（VIP）> 1且绝对log2倍数变化（|log2FC|）≥ 1.0的标准，鉴定了四个品种种子中的差异积累代谢物（DAMs）。随后对富集DAMs的途径进行代谢物集富集分析（MSEA），显著性通过超几何检验（p < 0.05）确定。
2.5. 叶绿素和类胡萝卜素含量测定
叶绿素和类胡萝卜素的提取与测定参照Gao等人[26]和Zhang等人[27]的方法并进行修改。简而言之，绿豆种子在液氮中研磨成粉末。随后，将1 g粉末用5 mL含0.1%（w/v）丁基羟基甲苯（BHT）的丙酮提取，超声处理60分钟，并以10,000 rpm离心15分钟。使用UV-1800分光光度计（上海美析仪器有限公司，上海，中国）在663、645和450 nm处测量上清液的吸光度，用于叶绿素和类胡萝卜素的定量。
2.6. 总黄酮、总酚、花青素含量及抗氧化能力测定
将绿豆种子粉末（2.0 g）与10 mL 80%乙醇混合，涡旋，并在40 kHz下超声处理15分钟。混合物在4 °C下以5000 rpm离心10分钟，收集上清液。重复提取两次，合并的上清液用80%乙醇定容至25 mL用于后续分析。总黄酮含量和ABTS+清除能力按照Fu等人[28]的方法测定。总酚含量、DPPH清除能力和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）按照Clarke等人[29]的方法测量。Trolox（纯度≥98%，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国）用作DPPH、ABTS+和FRAP测定的参考标准。制备梯度浓度的标准溶液（DPPH和ABTS+为0–200 μmol/L；FRAP为0–1000 μmol/L），并与每批样品同步测定以建立校准曲线。样品的抗氧化活性根据标准曲线计算，并以每公斤鲜重的毫克Trolox当量（mg TE/kg FW）表示。每个测定板中包含标准对照，以确保定量准确性和批次间一致性。花青素的提取和测定按照Zhuang等人[30]的方法进行。简而言之，将2.5 g绿豆种子粉末用25 mL酸化乙醇（95%乙醇:1.5 M HCl = 85:15，v/v）在黑暗中提取24小时。然后，使用UV-1800分光光度计（上海美析仪器有限公司，上海，中国）在535 nm处测量吸光度。
2.7. 统计分析
所有数据均表示为平均值±标准差（SD，n ≥ 3），并使用SPSS 27.0（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）基于完全随机设计进行单因素方差分析（ANOVA）。使用OriginPro 2021（OriginLab Corporation，北安普顿，马萨诸塞州，美国）进行主成分分析（PCA），以探索代谢组变异以及代谢物谱与抗氧化能力之间的关系[31]。使用Canoco（版本5.0，Microcomputer Power Corporation，伊萨卡，纽约州，美国）进行冗余分析（RDA），以量化代谢物类别、生物活性化合物和颜色参数对抗氧化活性的影响。RDA模型的显著性通过999次置换检验进行检验。
3. 结果
3.1. 不同色素沉积绿豆品种的代谢组分析结果
首先表征了四个绿豆品种的种皮颜色参数（图2A）。结果显示，YE和YG的L*值显著高于BL和GR，其中BL的L*值最低。a*值在YE中最高，其次是YG、BL和GR。YE和YG的b*值显著高于GR和BL。此外，YG表现出最高的百粒重和最大的种子尺寸，其次是YE、GR和BL（图2B）。
图2. 四个绿豆品种的表型特征和代谢谱比较。(A) L*、a*、b*颜色参数。L*代表亮度，a*代表红绿色度（正值=红色，负值=绿色），b*代表黄蓝色度（正值=黄色，负值=蓝色）。(B) 百粒重。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。不同小写字母表示品种间差异显著（p < 0.05，单因素方差分析后经Duncan多重极差检验）。(C) 代谢组谱的主成分分析（PCA）。(D) 样本间的Pearson相关系数。
使用UPLC-MS/MS分析了四个品种的代谢组谱。PCA显示四个品种明显聚类分离，BL和YE与YG和GR明显区分，表明与种皮颜色相关的代谢分化（图2C）。生物学重复之间确认了高重复性（r = 0.993–0.997）（图2D）。
3.2. 代谢组组成及代谢物丰度分析
从四个绿豆品种的种子中共鉴定出1544种代谢物（表S1）。这些代谢物可分为14类：氨基酸及其衍生物（301）、黄酮类化合物（299）、酚酸（160）、脂质（159）、萜类化合物（121）、生物碱（100）、有机酸（88）、糖类（76）、木脂素和香豆素（68）、核苷酸及其衍生物（67）、醌类（20）、维生素（13）、鞣质（8）和其他（64）。值得注意的是，某些代谢物仅在特定品种中检测到。例如，两种三萜皂苷仅在BL和YG中检测到，而花青素飞燕草素-3-O-(6″-O-阿魏酰)葡萄糖苷仅在BL和YE中检测到（其在BL中的含量约为YE的146倍）。
四个绿豆品种之间主要代谢物类别的相对丰度存在显著差异（图3A）。在所有品种中，YE的氨基酸及其衍生物相对信号比例最高，占总代谢组信号峰面积的31.85%。其次是GR（28.66%）、BL（28.50%）和YG（27.31%）。对于黄酮类化合物，BL的比例最高，为20.12%，分别是YE、YG和GR的1.47倍、1.41倍和1.10倍。GR的酚酸相对丰度最高，为9.38%，其次是YG（9.05%）、YE（8.85%）和BL（7.53%）。至于糖类，其相对丰度排序如下：YG（9.69%）> GR（9.12%）> YE（7.71%）> BL（6.37%）。对不同颜色绿豆品种的初级代谢物相对含量（基于峰面积）的比较分析揭示了相对信号丰度的显著差异。BL的黄酮类化合物、脂质和有机酸水平显著高于YE、YG和GR，其中黄酮类化合物含量是其他组的1.5–1.9倍。YE和BL的氨基酸及其衍生物水平也高于YG和GR。值得注意的是，木脂素和香豆素在YE中最高，分别是BL、YG和GR的1.21倍、1.29倍和1.56倍（图3B）。
图3. 四种不同种皮颜色绿豆品种种子中的代谢物组成和相对丰度。(A) 环状图显示主要代谢物类别的相对比例。扇形面积与代谢物类别百分比成比例。(B) 代谢物类别的相对丰度。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。不同小写字母表示品种间差异显著（p < 0.05，单因素方差分析后经Duncan多重极差检验）。
层次聚类分析（HCA）揭示了四个品种之间不同的代谢物积累模式（图4）。氨基酸及其衍生物、黄酮类化合物和酚酸在YE和BL中的含量高于YG和GR。萜类化合物、木脂素和香豆素在YE中积累较高，而脂质和有机酸在BL中最为丰富。此外，GR的鞣质丰度最高。
图4. 所有检测代谢物的层次聚类热图。颜色代表归一化的相对丰度（红色，高；绿色，低）。
3.3. 差异积累代谢物（DAMs）的鉴定
使用|log2FC| ≥ 1且VIP > 1的标准，在四个绿豆品种的六组成对比较中共鉴定出647种差异积累代谢物（DAMs）（表S2）。K-means聚类根据积累模式将这些DAMs分为四个亚类（图5A）：亚类1（203个DAMs，31.4%）：以在BL中积累最高为特征，富含黄酮类化合物（32.0%）和脂质（20.7%）；亚类2（126个DAMs，19.5%）：在GR中积累最高，主要成分为氨基酸及其衍生物（27.8%）和黄酮类化合物（19.8%）；亚类3（247个DAMs，38.2%）：在YE中积累最高，以黄酮类化合物（25.5%）、氨基酸及其衍生物（17.4%）、萜类化合物（16.2%）和酚酸（14.2%）为主；亚类4（71个DAMs，11.0%）：在YG中积累最高，主要由氨基酸及其衍生物（24.3%）组成。
图5. 差异积累代谢物（DAMs）的鉴定和聚类分析。(A) K-means聚类分析将647个DAMs根据在BL、YE、YG和GR中的积累趋势分为四个亚类。(B) 六组比较中DAMs的Venn分析结果。(C) 各比较中鉴定到的DAMs的火山图。红点表示显著上调，绿点表示显著下调，灰色表示无显著差异。x轴显示log2（倍数变化，FC）；y轴显示?log10（p值）。
在647个DAMs中，分别在GR_vs_BL、GR_vs_YE、GR_vs_YG、YE_vs_BL、YG_vs_BL和YG_vs_YE比较中鉴定出34、42、19、14、22和30个特异性代谢物。这些比较特异性DAMs主要属于黄酮类化合物、酚酸和氨基酸衍生物。对于以BL为中心的比较（GR_vs_BL、YG_vs_BL和YE_vs_BL），鉴定出62个共享DAMs，其中59个（95.2%，包括20种游离脂肪酸、13种黄酮醇和5种花青素）在BL中上调——与BL富含脂肪酸和黄酮类化合物亚类一致。相比之下，以YE为中心的比较（GR_vs_YE、YE_vs_BL和YG_vs_YE）共享12个DAMs，其中10个（83.3%）在YE中上调，主要为黄酮类化合物（例如牡荆素衍生物和异黄酮）（图5B）。只有一个DAM，1-甲基黄嘌呤，在所有六组比较中共享，在YE中积累最高，分别是BL、YG和GR的4.42倍、2.02倍和1.20倍。
在所有六组成对比较中，DAMs的总数从168个（GR和YG之间）到350个（GR和BL之间）不等（图5C）。值得注意的是，BL和YE在各自的比较中表现出高比例的上调DAMs。这一发现表明BL和YE种子可能比GR种子拥有更丰富的代谢物谱。
3.4. DAMs的KEGG富集分析
使用KEGG数据库[32,33]进行代谢途径富集分析。来自六组成对比较（GR_vs_BL、YE_vs_BL、YG_vs_BL、GR_vs_YE、YG_vs_YE和GR_vs_YG）的DAMs分别富集了70、39、62、66、47和43条途径（图6A）。
图6. 代谢途径富集和代谢物定量分析结果。(A) 六组成对比较的KEGG途径富集气泡图。富集因子（x轴）表示富集DAMs与总背景代谢物的比率。途径名称（y轴）在p < 0.05时以红色显示。点颜色从蓝色到红色的渐变表示p值减小；点大小与DAM数量成比例。(B) 黄酮类化合物相对含量。(C) 牡荆素及其衍生物相对含量。(D) 氨基酸及其衍生物相对含量。每个条形代表一个单独的代谢物。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。不同小写字母表示品种间差异显著（p < 0.05，单因素方差分析后经Duncan多重极差检验）。
以BL为中心的比较（GR_vs_BL、YG_vs_BL和YE_vs_BL）的DAMs在脂肪酸代谢（亚油酸代谢，ko00591；α-亚麻酸代谢，ko00592）和黄酮类化合物生物合成（花青素生物合成，ko00942；黄酮和黄酮醇生物合成，ko00944）途径中显示出显著富集。值得注意的是，BL中游离脂肪酸相关的DAMs特异性富集在亚油酸和α-亚麻酸代谢中。以YE为中心的比较（GR_vs_YE、YG_vs_YE和YE_vs_BL）在异黄酮生物合成（ko00943）、一般黄酮类化合物生物合成（ko00941）和组氨酸代谢（ko00340）途径中富集。YE中异黄酮相关的DAMs独特富集在异黄酮生物合成途径中。以GR和YG为中心的比较显示在咖啡因代谢（ko00232，这是所有六组比较的DAMs唯一共同富集的途径）以及精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）途径中富集。特定比较中的共享途径包括苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成和甜菜红素生物合成（所有DAMs在GR/YG_vs_BL比较中上调），以及次生代谢物生物合成和氨酰-tRNA生物合成（大多数DAMs在GR/YG_vs_YE比较中于YE中上调）途径。花青素生物合成途径在BL_vs_GR/YG/YE比较中特异性富集，而黄酮/黄酮醇生物合成途径在BL_vs_YG/YE和YE_vs_GR/YG比较中持续富集（表S7）。
3.5. 四个绿豆品种种子中的主要生物活性差异积累代谢物
为了进一步阐明关键代谢物的相对丰度和生物活性功能，我们基于全面的代谢物谱分析和DAM分析，重点关注绿豆的主要成分——包括多酚（黄酮类化合物和酚酸）、游离脂肪酸和氨基酸。
3.5.1. 黄酮类化合物
共鉴定出299种黄酮类代谢物，包括89种黄酮、69种黄酮醇、34种黄烷酮、26种异黄酮、22种花青素、17种其他黄酮类化合物、16种查尔酮、16种黄烷醇和10种黄烷酮醇。异黄酮和黄酮在YE中含量最高，显著高于BL、YG和GR。然而，黄酮醇和花青素在BL中显著富集，分别是YE、YG和GR的5.10倍、8.16倍和6.63倍（黄酮醇）以及9.96倍、18.06倍和14.55倍（花青素）（图6B）。
异黄酮DAMs（YE_vs_BL/YG/GR）在异黄酮生物合成中富集。樱黄素、大豆黄酮苷、6″-O-丙二酰大豆苷、大豆苷和大豆苷元在YE中高出1.97至9.34倍。注释在花青素生物合成途径中的三种花青素（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-(6″-O-对香豆酰)葡萄糖苷、锦葵花素-3-O-葡萄糖苷），以及未在该途径中注释的两种花青素（飞燕草素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷），在BL中显示出22.32至565.21倍的增加。此外，飞燕草素-3-O-(6″-O-阿魏酰)葡萄糖苷仅在BL和YE中检测到，其在BL中的含量比YE高146.05倍。黄酮醇DAMs（BL_vs_YE/YG/GR）在黄酮和黄酮醇生物合成中富集。芦丁、百脉根素和七种未注释的黄酮醇在BL中高出2.54至33.0倍。黄酮DAMs（YE_vs_others）在同一途径中富集，金合欢素在YE中高出2.25至4.24倍。YE表现出最高的牡荆素和异牡荆素衍生物含量（比其他品种高1.22至1.90倍；图6C），其中牡荆素-2″-O-鼠李糖苷（VOR）和异牡荆素-2″-O-鼠李糖苷是主要成分。相反，牡荆内酯在BL中最高（是其他品种的3.38至5.03倍）（表S3）。
3.5.2. 游离脂肪酸
KEGG富集分析表明，BL与YE/YG/GR之间的DAMs在亚油酸代谢途径中显著富集。与YE、YG和GR相比，包括TriHOME和EpOME在内的九种游离脂肪酸在BL中高出3.11至20.07倍。此外，四个DAMs在α-亚麻酸代谢途径中显著富集，在BL中达到YE、YG和GR的2.08至6.01倍（表S4）。
3.5.3. 酚酸
检测到33种游离酚酸，其中苯甲酰苹果酸、2-O-咖啡酰葡萄糖二酸、4-羟基苯甲酸、2-羟基肉桂酸和α-羟基肉桂酸是前五位。游离酚酸占BL总酚酸的23.61%，显著高于YE（19.46%）、YG（18.46%）和GR（18.27%）（表S5）。
3.5.4. 氨基酸及其衍生物
在绿豆种子中检测到所有20种蛋白氨基酸以及二肽至五肽。其中，L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-精氨酸在所有品种中含量丰富。L-组氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸和L-蛋氨酸在BL和YE中显著高于YG和GR（表S6）。必需氨基酸及其衍生物含量在YE中最高，分别是BL、YG和GR的1.06倍、1.39倍和1.24倍（图6D）。
3.6. 抗氧化活性和生物活性化合物含量测定
绿豆富含黄酮类化合物和酚酸等次生代谢物，这些物质通过其抗氧化活性对人类健康具有显著贡献，使其成为天然抗氧化剂的理想来源。使用DPPH、ABTS+和FRAP测定法评估了绿豆提取物的抗氧化活性（图7A–C）。YG表现出最高的DPPH清除活性（297.7 ± 29.7 mg TE/kg FW），显著超过BL和YE（p < 0.05）。YE显示出数值上最高的ABTS+清除能力（592.4 mg TE/kg FW），其次是GR、BL和YG，其他三个品种的值范围为428.9至547.2 mg TE/kg FW。然而，四个品种之间的ABTS+清除能力没有观察到统计学显著差异（p > 0.05）。BL显示出最强的FRAP还原力（398.1 mg TE/kg FW），而YE显示出最低（342.5 ± 12.2 mg TE/kg FW，p < 0.05）。这些依赖于方法的差异反映了测定反应机制的差异，而不是绝对抗氧化能力的差异。
图7. 四种不同种皮颜色绿豆品种的生理生化指标。(A) DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼基）清除能力。(B) ABTS+（2,2′-联氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸））清除能力。(C) FRAP（铁离子还原抗氧化能力）。(D) 总酚含量。(E) 总黄酮含量。(F) 花青素含量。(G) 叶绿素a含量。(H) 叶绿素b含量。(I) 类胡萝卜素含量。所有抗氧化活性测定均以Trolox为参考标准，结果以Trolox当量表示。FW：鲜重。柱上方的不同小写字母表示品种间差异显著（p < 0.05）。
测定了四种种子颜色品种绿豆中生物活性物质的含量。四个绿豆品种的总酚含量差异显著：YE（9.24 mg/g FW）和BL（9.06 mg/g FW）的总酚含量排名前两位，高于GR（8.35 mg/g FW），但显著高于YG（7.49 mg/g FW）（图7D）。通过生理分析测定的总黄酮含量在各品种间没有显著差异（图7E），这一发现与代谢组学分析不同，可能归因于检测灵敏度的差异或代谢组学分析中未捕获的次要黄酮亚类的贡献。BL表现出最高的花青素含量，分别是YE、YG和GR的4.17倍、3.24倍和2.58倍（图7F）。这一结果在变化趋势上与代谢组学数据一致，但两种方法的倍数变化幅度不同。
叶绿素a和b含量在BL和GR中最高，在YG中居中，在YE中最低（图7G,H）。类胡萝卜素在GR中最为丰富，分别是BL、YG和YE的1.22倍、1.32倍和2.33倍（图7I）。
3.7. PCA和RDA
PCA显示PC1解释了水平轴上34.9%的变异，而PC2解释了垂直轴上33.8%的变异（图8A）。GR和YG在PCA图交点右侧形成一个聚类，而BL和YE彼此远离，也远离其他两个品种。大多数代谢物（除鞣质、维生素和糖类外）和生物活性物质（总黄酮、总酚和花青素）的含量与BL和YE呈正相关，但与GR和YG呈负相关，而鞣质、维生素和糖类与GR和YG呈正相关。光合色素，包括叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素，与GR、YG和BL呈正相关，而与YE呈负相关。花青素含量与BL呈正相关，与YE、GR和YG呈负相关。此外，抗氧化能力，如DPPH和FRAP，与GR和YG呈正相关，而ABTS+与YE呈正相关，但与BL呈负相关。
图8. 四个绿豆品种的代谢和表型性状的综合分析。(A) 代谢物谱和生理参数的PCA。蓝色箭头表示代谢物类别（氨基酸、黄酮类化合物、酚酸、脂质、萜类化合物、生物碱、有机酸、木脂素、香豆素、核苷酸、醌类、鞣质、糖类、维生素）；红色箭头表示生物活性化合物（总黄酮、总酚、花青素）和光合色素（叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素）；紫色箭头表示颜色参数（L*、a*、b*）。圆圈代表具有三个生物学重复的品种平均值。(B) 以代谢物和颜色参数为约束的抗氧化活性RDA。RDA模型通过999次置换检验验证（p < 0.05）。星号表示p < 0.05（*）和p < 0.01（**）水平的显著性。
RDA的第一轴和第二轴分别解释了总变异的57.5%和34.3%。氨基酸及其衍生物总含量是影响最大的因素，其次是脂质。总氨基酸及其衍生物含量与DPPH和FRAP显著负相关，与ABTS+正相关。总脂质含量与DPPH显著负相关（图8B）。
4. 讨论
4.1. 不同种皮颜色绿豆的核心代谢物类别和整体代谢组学特征
代谢组学已被广泛应用于研究作物种子颜色形成机制及相关的代谢差异。在甜高粱中，代谢组学分析揭示了白色、红色和黑色种子之间的不同谱图，在黄酮类化合物和花青素方面存在显著差异[34]。在黍子[35]和大豆[36]中也观察到了类似的模式。在谷类作物中，整合的代谢组学和转录组学分析表明，黄酮类化合物生物合成途径与颜色形成密切相关[37,38]。这些研究为研究不同色素沉积绿豆的代谢差异奠定了技术基础。在本研究中，对四种具有明显种皮颜色的绿豆品种进行的代谢组学分析鉴定出1544种代谢物。氨基酸及其衍生物、黄酮类化合物、酚酸、脂质和萜类化合物是相对信号丰度最高的五类，共占总代谢物的64.3%。这一谱图与绿豆作为高蛋白、富含生物活性成分食品的功能特性一致[1,6]。氨基酸在所有品种中排名第一（27.31–31.85%），这与绿豆储存蛋白的营养价值一致[39]。黄酮类化合物作为第二大类（13.69–20.12%），其亚类组成在品种间存在显著差异，反映了与种皮颜色相关的核心代谢组学特征。这些结果与大豆[36]和其他谷物[35,38]的发现相似，表明种皮颜色对次生代谢的调控是豆科和谷类作物中保守的生物学现象。
4.2. 不同种皮颜色绿豆特征代谢物的积累模式与功能分析
四个绿豆品种的代谢谱揭示了与种皮颜色相关的不同积累模式，并暗示了特定的功能角色。黑籽绿豆呈现出独特的代谢表型，特异性积累了黄酮类化合物、花青素、游离脂肪酸和酚酸。黄酮醇是黑绿豆中占主导地位的黄酮亚类，包括芦丁和百脉根素在内的多种黄酮醇糖苷高度富集。芦丁已在人体研究中被广泛证明具有抗炎、抗糖尿病、抗氧化、神经保护、肾脏保护和肝脏保护活性[40]。同样，百脉根素（槲皮素-3-O-葡萄糖苷）和其他黄酮醇糖苷表现出增强的生物利用度和相当的生物活性特性，包括抗炎、抗氧化和抗癌[41]。这些化合物在BL中的大量富集为其在功能性食品配料中的潜在应用提供了物质基础，但其体内健康效应仍需进一步验证。花青素是导致黑色种皮表型的关键物质[23]。多种花青素和花青素在黑色绿豆中显著上调，这与黑大豆和黑米等其他深色粗粮的色素积累特征一致[19,38]。除了苯丙烷代谢外，BL在亚油酸和α-亚麻酸代谢途径中也表现出显著富集（p < 0.05），九种游离脂肪酸（如TriHOME、EpOME）高出3.11–20.07倍，四种α-亚麻酸代谢物高出2.08–6.01倍，可能增强了脂溶性抗氧化活性[12]。游离酚酸（占总酚的23.61%）显著高于YE（19.46%）、YG（18.46%）和GR（18.27%），证实了黑色种子中酚类积累的增加[11,19]。
黄籽绿豆的特征是氨基酸及其衍生物的丰富积累，八种必需氨基酸比其他品种高1.06–1.39倍，必需氨基酸水平显著高于其他品种。值得注意的是，YE和BL中的L-蛋氨酸比YG和GR高出约三倍，解决了绿豆中典型的含硫氨基酸缺乏问题[5,39]。关键氨基酸（L-组氨酸和L-缬氨酸）显著高于YG/GR，很好地支持了YE作为高蛋白品种的用途[5]。在黄酮类代谢方面，黄绿豆倾向于合成异黄酮和常见黄酮，且异黄酮生物合成途径明显富集。大豆苷、大豆苷元和樱黄素等异黄酮特异性高表达。大豆苷是YE中的主要异黄酮，已被证明作用于线粒体单胺氧化酶-醛脱氢酶途径，有助于其抗酒精和代谢调节活性[42]。同时，樱黄素是YE中另一种上调的异黄酮，通过灭活TLR4/MyD88途径抑制炎症细胞因子的产生[43]——突显了YE来源异黄酮的功能多样性[27,44]。黄绿豆中的异黄酮富集类似于黄大豆中观察到的代谢特化，其中异黄酮作为有益健康的主要生物活性化合物[45]。此外，牡荆素、异牡荆素及其糖苷衍生物在黄绿豆中含量最高，其中牡荆素-2″-O-鼠李糖苷被鉴定为特征性高含量黄酮[46]。牡荆素和异牡荆素是食用
