超越水肿：遗传性血管性水肿诊断与管理的临床见解

《International Journal of Molecular Sciences》：Beyond Swelling: Clinical Insights into the Diagnosis and Management of Hereditary Angioedema

　　

在tau蛋白病中，大脑中无义介导的降解（NMD）靶基因的失调仍然知之甚少。研究人员评估了表达人突变型P301S tau的PS19转基因小鼠中NMD靶点长链非编码RNA Gas5（lncRNA Gas5）的水平。结果表明，随着PS19小鼠年龄增长，其大脑中的Gas5水平下降。研究人员通过向PS19小鼠鼻内给予一种小分子，评估了阻断NMD介导的Gas5周转的后果。结果表明，NPC86解离了Upf1和Gas5，从而阻碍了NMD过程。NPC86处理增加了雄性PS19小鼠皮层中的Gas5水平，同时伴随pTau S214和神经炎症基因的极显著减少，并增加了胰岛素信号传导。随后，数字空间分析（DSP）鉴定了受Gas5调节的基因和通路。NPC86处理增强了神经元稳态、突触囊泡运输和线粒体功能，并下调了神经炎症通路。响应NPC86处理，帕金森病信号通路、多发性硬化症信号通路、Gα(s)信号通路、神经炎症信号通路以及干扰素γ信号通路中的节点基因表达量下降。该研究证明了选择性稳定NMD靶标lncRNA Gas5水平以缓解tau蛋白病早期神经退行性病变的潜力。

在tau蛋白病（如进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病、帕金森病、额颞叶变性等）中，大脑内tau蛋白的病理性积累是其标志性特征。这类疾病影响较年轻的人群，且给患者带来沉重的经济负担。tau蛋白的突变（如P301S）会促进其异常过度磷酸化和聚集。无义介导的降解（NMD）通路是识别和靶向转录本进行周转的关键监测机制，能够降解错误剪接或存在基因突变的转录本。尽管NMD通路在其他器官中研究较为深入，但NMD通路的靶基因在神经退行性疾病尤其是tau蛋白病中的作用仍知之甚少。长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5（lncRNA Gas5）在正常大脑中调节胰岛素信号传导，且其水平受NMD通路调控。由于完全抑制核心NMD机制或耗竭其关键起始蛋白Upf1会影响正常的基因转录后调控及关键监测功能，研究人员开发了能够特异性阻断Upf1与Gas5结合的小分子NPC86，以阻碍NMD介导的Gas5周转。研究人员利用NPC86作为分子工具，在PS19 tau转基因小鼠模型中评估了阻断NMD介导的Gas5周转的后果。研究发现，阻断NMD通路增加了Gas5的水平，并减缓了PS19小鼠中与年龄相关的神经退行性病变进程。该研究表明，通过NMD通路选择性调节转录本周转以增加关键lncRNA水平，具有减缓神经退行性疾病发生的潜力。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

在关键技术方法方面，研究人员从Jackson Laboratory购买了PS19转基因小鼠及非转基因同窝仔鼠作为样本队列来源。在体内实验中，对小鼠进行鼻内给予NPC86处理，并分为两个队列：组1从5个月龄开始给药4个月，组2从8个月龄开始给药1个月。随后进行了行为学测试以评估运动和认知功能。在组织与分子水平上，采用了微滴式数字PCR（ddPCR）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）来定量Gas5水平；利用免疫组织化学（IHC）、RNAscope和RNA荧光原位杂交联合免疫荧光（RNA-FISH/IF）观察基因与蛋白的定位及丰度；通过RNA免疫沉淀（RIP）测定评估RNA与蛋白的结合；使用Jess自动化蛋白质印迹系统分析蛋白表达；利用GeoMx数字空间分析（DSP）进行空间转录组学和通路富集分析。此外，在过表达突变型tauP301L的HEK293细胞中进行了体外验证。

2.1. PS19小鼠大脑中的Gas5水平较低
研究人员通过ddPCR和RT-qPCR检测发现，与同龄非转基因（Ntg）小鼠相比，9个月大的PS19小鼠在皮层中的Gas5水平显著降低。这表明Gas5水平降低是tau蛋白病病理过程中的早期事件。

2.2. 鼻内给予NPC86增加PS19小鼠的Gas5水平
通过RT-qPCR和RNAscope检测发现，鼻内给予NPC86显著增加了雄性PS19小鼠皮层中的Gas5水平，而雌性小鼠对此响应不显著。NPC86处理未影响小鼠体重，且在脑部及其他器官中未显示毒性。后续研究主要集中于9个月大的雄性PS19小鼠皮层。

2.3. NPC86阻断NMD介导的Gas5周转
研究人员通过RIP测定发现，PS19小鼠皮层中Upf1与Gas5的结合增加。NPC86处理阻断了Upf1与Gas5的结合，从而阻断了NMD介导的Gas5周转，导致Gas5水平升高。

2.4. NPC86处理缓解神经元胰岛素信号传导并降低Tau磷酸化
通过自动化蛋白质印迹分析发现，NPC86处理增加了Akt的磷酸化，表明胰岛素信号传导增强。同时，NPC86处理显著降低了pTau S²¹⁴和pTau S²⁰²/T²⁰⁵的水平，但未改变Thr²³¹、Ser⁴⁰⁴或Ser⁴¹⁶位点的磷酸化。RNA-FISH/IF分析显示，NPC86处理后Gas5与Tau-5的共定位减少。行为学测试表明，NPC86处理改善了PS19小鼠的短期记忆和运动功能。

2.5. NPC86处理PS19小鼠的数字空间分析（DSP）
通过GeoMx DSP技术对皮层、海马体和中脑进行空间转录组分析。差异表达基因（DEG）分析显示，NPC86处理后上调了参与突触功能、囊泡运输、线粒体健康和能量代谢的基因（如Vamp2、Ube2n、Tpi1、Acot13），下调了与神经炎症相关的基因。过表达分析（ORA）表明，NPC86处理下调了帕金森病信号通路、多发性硬化症信号通路、Gα(s)信号通路、神经炎症信号通路和干扰素γ信号通路。NPC86处理还预测上调了NMDA受体（NMDAR）通路并降低了NCX受体。

2.6. 破坏失调的NMD介导Gas5周转减少神经炎症
通过免疫荧光染色发现，NPC86处理显著降低了皮层中小胶质细胞标记物Iba1和激活的星形胶质细胞标记物GFAP的丰度，表明促炎性小胶质细胞和激活的星形胶质细胞减少，从而减轻了神经炎症。

2.7. DSP结果的验证
通过RT-qPCR验证了DSP分析的结果，证实了Acot13、App、Scoc、Tpi1、Ube2n和Vamp2 mRNA水平在NPC86处理后显著增加，而Dync1Li2和Nos1 mRNA水平降低。此外，IFNα、IFNβ、TLRs和TNFα等神经炎症基因表达下降。

2.8. NPC86处理中Gas5依赖性结果的验证
在过表达突变型tauP301L的HEK293细胞中，通过siRNA敲低GAS5并进行蛋白质印迹分析，结果表明NPC86对Tau S²¹⁴磷酸化的降低作用在GAS5耗竭后被消除，证实了NPC86以Gas5依赖的方式显著降低tau S²¹⁴磷酸化。

在讨论部分，研究人员指出Gas5作为一种多效性lncRNA，通过其茎环结构结合多种分子发挥作用。NPC86介导的Gas5水平稳定促进了神经元PI3K/Akt信号通路，为神经递质释放和代谢提供能量。上调的Vamp2可能促进突触囊泡与神经元膜的融合；Ube2n增加可能促进受损线粒体的自噬降解；TPI1和Acot13的上调则有助于改善大脑能量代谢和脂质代谢。此外，NPC86降低pTau S²¹⁴，可能减轻了tau与Fyn结合受损带来的谷氨酸能突触传递和Ca²⁺内流障碍。同时，NPC86处理降低了Trem2和Toll样受体家族的水平，从而抑制了小胶质细胞介导的神经炎症。研究结论表明，PS19小鼠存在失调的神经元网络，而抑制NMD介导的Gas5周转可通过影响大脑代谢、突触囊泡运输、线粒体功能和神经网络内的细胞骨架组织来增强神经元稳态，并减少神经炎症。研究确立了NMD通路在tau蛋白病发展中的关键作用，支持了通过选择性调节NMD通路的转录本周转来增加关键lncRNA水平，从而减缓神经退行性疾病发生的潜力。