抑制 Importin-8 可减少 Ataxin-3 的聚集，从而缓解 Machado-Joseph 病（脊髓小脑性共济失调 3 型）的症状

《iScience》：Importin-8 silencing reduces Ataxin-3 aggregation and alleviates Machado-Joseph disease/spinocerebellar ataxia type 3

　　**亮点：**
- Imp8下调可以减少MJD细胞和动物模型中的Atxn3聚集
- Ipo8沉默能够改善Machado-Joseph病小鼠的运动表现和步态
- Imp8可能通过调节NF-kB/p65和Ago2的表达来影响MJD的发病机制
- 降低Ipo8水平可能是延缓MJD疾病进展的有效策略

**摘要：**
Machado-Joseph病（MJD）是一种多聚谷氨酰胺神经退行性疾病，其特征是神经元核内形成Ataxin-3聚集物。从神经退行性变的早期阶段开始，核质转运就出现了严重紊乱，这进一步加剧了疾病的进展性。为了了解这些蛋白质在MJD中的作用，我们筛选了34种转运蛋白对Ataxin-3聚集的影响。Importin-8（Ipo8基因）被选为进一步进行神经病理学和行为分析的对象，以评估其在体外和体内的调节作用。我们的结果显示，在MJD中Ipo8 mRNA表达增加，而Ipo8下调可以减少体外和体内的Ataxin-3聚集以及神经元功能障碍。此外，Ipo8沉默被证明可以减轻体内的共济失调症状。总体而言，我们的发现表明Importin-8可能通过调节NF-kB/p65和Argonaute-2蛋白来发挥其保护作用，这两种蛋白之前也被发现与MJD相关，因此成为延缓疾病进展的有希望的治疗靶点。

**引言：**
Machado-Joseph病（MJD），也称为脊髓小脑性共济失调3型，是全球最常见的常染色体显性遗传共济失调症。它属于多聚谷氨酰胺（polyQ）神经退行性疾病家族。尽管在全球范围内较为罕见，但在亚速尔群岛的Flores岛上，该病的发病率高达1:239。致病突变位于14号染色体上的ATXN3基因（14q32.1）中，表现为CAG序列的不稳定重复，这导致生成的Ataxin-3蛋白中出现异常的多聚Q结构。多聚Q扩展赋予Atxn3毒性，使其容易在神经细胞中形成核聚集物，并引发多种细胞机制的功能障碍。这些事件最终导致神经系统特定区域的神经元死亡。受影响最严重的脑区包括小脑、脑干和纹状体，从而导致运动协调障碍、姿势不稳、构音障碍和吞咽困难等症状。MJD的精确病理机制尚不清楚，但已证实毒性变化与Atxn3蛋白聚集之间存在直接关联。有趣的是，蛋白质的核定位似乎是聚集过程的关键因素。其他机制，如蛋白质切割、自噬紊乱、神经炎症和转录失调也被发现与疾病有关。我们之前的研究以及其他平行研究已经建立了Atxn3亚细胞定位调节与特定核质转运蛋白之间的联系。此外，还有研究揭示了核质转运机制在其他神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆、阿尔茨海默病和亨廷顿病）中的作用，而不仅仅是受影响蛋白质的定位。这些研究表明，核质转运的普遍紊乱不仅会加剧病理性聚集物的形成，还会破坏其他大分子的亚细胞定位。核转运是一个高度调控的过程，控制着蛋白质和RNA分子在细胞核与细胞质之间的交换。这种主动运输由核转运蛋白（或称为导入蛋白/导出蛋白）完成，具体取决于运输方向。这些蛋白通过核输出信号（NESs）和核定位信号（NLSs）与货物结合，然后通过核孔复合体进行运输。Atxn3蛋白结构中已鉴定出NLS和NES结构域，进一步加强了其与核质转运机制相互作用的假设。

鉴于核质转运功能障碍可能促进多种神经退行性疾病的发展，我们的研究重点在于识别能够调节Atxn3聚集并潜在逆转MJD病理学中观察到的亚细胞异常的核质蛋白。我们基于科学界现有的核质转运蛋白名单，筛选了34种蛋白质。该名单包括两大类核质转运蛋白：导入蛋白和导出蛋白，以及协同因子（如karyopherin-β1 (KPNB1)和其他β族核转运蛋白），以及维持核质转运循环的蛋白质（如Ran、RanGAP1和Ran结合蛋白RanBP1、2、3）。在本研究中，我们发现Importin-8（IPO8，也称为Ran结合蛋白8）是有效的Atxn3聚集调节因子，且其亚细胞定位未发生明显改变。有趣的是，在小鼠模型中，扩展型Atxn3的表达似乎会诱导Ipo8（小鼠IPO8编码基因）的表达，而在野生型动物中，尤其是在MJD受影响的区域（如小脑）中，该基因的表达相对较低。我们的体外和体内研究表明，Ipo8沉默可以减少Atxn3聚集，从而缓解共济失调症状、运动协调和平衡障碍。此外，我们的发现表明Ipo8沉默不仅可以抑制与Atxn3聚集相关的MJD病理过程，还可能调节其他已知靶点：与神经炎症相关的转录因子p65（NF-kB复合体的p65亚基）以及与mRNA沉默和代谢相关的Argonaute RISC催化成分2（Ago2）。这些机制在MJD中已被报道存在异常。我们的结果证明，核质转运机制在MJD等神经退行性疾病中的重要性不仅体现在受影响蛋白质的定位上，还包括通过恢复核质转运平衡来预防多条细胞途径的功能障碍。因此，我们强调了Ipo8作为MJD发病机制的新贡献因素，并提出了一个有希望的治疗靶点以延缓疾病进展。

**结果：**
- Ipo8调节显著影响Atxn3聚集
- 既往研究表明核质转运蛋白对多种神经退行性疾病有显著影响。为了探讨这类蛋白是否调节Atxn3聚集并在MJD的发病机制中起作用，我们使用siRNA技术在HEK-293T MJD细胞模型中进行了Ataxin-3聚集测定（图S1A），以减少几种核质蛋白的表达。首先使用针对GFP的siRNA测试其在HEK-293T细胞模型中的效果（图S1B和S1C），随后使用siCRM1、siTNPO1和siIPO13进行选择性研究（图S1D）。然后选择34种导入蛋白、导出蛋白及其他参与整个导入/输出循环维护的蛋白质，分析它们对148Q-Atxn3在HEK-293T细胞模型中的影响（表S1）。
- 通过过滤陷阱分析评估所选siRNA对148Q-Atxn3聚集的调节作用（图1A），其中一些siRNA的沉默效率得到确认并显示在图S2中。我们观察到siRNA介导的Ipo8沉默显著减少了Atxn3聚集，而RAN鸟苷酸释放因子（RANGRF）或RAN结合蛋白1（RANBP1）的沉默则增加了Atxn3聚集（图1A）。
- 图1：IPO8调节显著改变Atxn3聚集水平
- （A）HEK-293T细胞中表达148Q-Atxn3并沉默34种不同转运蛋白的过滤陷阱分析。siIPO8（0.6369 ± 0.1058, p = 0.0337）显著减少了Atxn3聚集，而siRANGRF（1.284 ± 0.090, p = 0.0449）和siRANBP1（1.321 ± 0.091, p = 0.0312）增加了Atxn3聚集。
- （B）膜分析显示，在HEK-293T细胞中沉默11种不同转运蛋白并分析148Q-Atxn3聚集时，与siIPO8（0.5706 ± 0.1809, p = 0.0305）或siIPO7（0.7918 ± 0.0609, p = 0.0059）共转染时，formic acid可溶性Atxn3显著减少。
- （C）在过表达IPO8的HEK-293T细胞中，与全长IPO8共转染时148Q-Atxn3聚集显著增加（4.747 ± 0.6185, p = 0.0008），而与截短形式的IPO8共转染时显著减少（1.300 ± 0.0528, p = 0.0012）。
- （D）N2a细胞转染72Q-Atxn3并与shIPO8共转染时，Triton X-100可溶性Atxn3水平显著增加（shIPO8：0.552 ± 0.057, p = 0.0068 vs. shCTR：0.323 ± 0.058）。
- （E）SDS-PAGE分析显示，在N2a细胞转染27Q或72Q-Atxn3并与shCTR或shIPO8共转染时，27Q（IPO8：0.5095 ± 0.0857；Empty：1.000 ± 0.1196, p = 0.0158）和72Q-Atxn3（IPO8：0.5135 ± 0.1031；Empty：1.000 ± 0.1001, p = 0.0148）水平无统计学差异。
- 使用Koch等人之前描述的相同方法进行分馏分析。与过滤陷阱测量结果一致，Ipo8沉默显著减少了formic acid可溶性Atxn3聚集，对应于较大和晚期的聚集物（图1B）。此外，当细胞与siIPO8共转染时，观察到细胞活力显著增强（图S3）。
- 为了探索Ipo8过表达是否会引起相反的结果，我们在表达148Q的HEK-293T细胞模型中使用全长IPO8构建体（pCMV-SPORT6-IPO8）进行了过滤陷阱分析。预期的是，Ipo8过表达显著增加了148Q-Atxn3聚集（图1C）。有趣的是，当与缺乏IBB/货物识别结构的截短形式IPO8共转染时，这种效应不再出现（图1C），表明Atxn3聚集的调节特异性依赖于Ipo8的货物识别结构域。为了在神经细胞模型中研究Ipo8沉默效果，我们使用72Q-Atxn3在N2a细胞中短暂表达，并与shRNAs共转染以特异性沉默小鼠Ipo8（LV-PGK-EGFP-H1-shIPO8）。在N2a MJD细胞模型中，shIPO8增加了Triton X-100可溶性72Q-Atxn3的含量，而不影响SDS或formic acid可溶性聚集物（图1D）。
- 为了评估这种效应是否由Atxn3蛋白水平的变化引起，N2a细胞被转染27Q或72Q形式的Atxn3，并与shCTR或shIPO8共转染，通过SDS-PAGE分析总蛋白水平（图1E）。Ipo8沉默后，无论转基因（27Q或72Q）还是内源形式的Atxn3水平与对照组相比均未改变，证实Ipo8下调不影响Atxn3的总蛋白水平（图1E）。此外，在Ipo8沉默的N2a细胞中，Atxn3 mRNA水平也没有变化。在注射shCTR或shIPO8的Wt或69Q Tg动物体内也未观察到变化（图S4），表明Ipo8沉默不改变Atxn3表达。在N2a细胞模型中过表达IPO8时，可溶性27Q和72Q-Atxn3蛋白水平显著下降（图1F）。我们推测这种效应可能是由于Atxn3寡聚化或清除增加，使其无法在预期分子量下被检测到。这一假设也得到了内源性小鼠Atxn3蛋白水平在Ipo8下调和上调时均保持不变的支持（图S5）。
- 总体而言，我们的结果表明，尽管Ipo8下调和上调并未显著改变Atxn3的总蛋白水平和mRNA表达，但它们显著调节了Atxn3的溶解性。此外，研究结果表明，Ipo8的沉默可能对体外MJD模型的细胞存活也有积极影响。在不同的MJD体内模型中，Ipo8的mRNA表达存在失调。我们证明了IPO8是一个重要的Atxn3聚集调节因子。然而，到目前为止，关于IPO8在成年大脑中的表达和分布以及其在MJD背景下是否发生改变知之甚少。考虑到这一点，我们通过SDS-PAGE方法评估了这种蛋白质在4个月大Wt小鼠不同脑区的表达情况，包括小脑、脑干、海马体、纹状体和皮质。观察到IPO8在海马体中的表达水平相对较高，在脑干、纹状体和皮质中的表达为中等，在小脑中的表达较低（图2A）。这些数据表明，IPO8可能在不同的脑区发挥不同的作用，并且至少在其典型大小下，其表达在小脑中可能较低，而小脑是MJD受影响最严重的脑区之一。

图2 IPO8在不同脑区中的表达有所不同，在MJD动物模型中Ipo8 mRNA的水平增加

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(A) 不同小鼠脑区中IPO8的免疫印迹检测及其相应的直方图，显示在海马体中的IPO8蛋白水平高于小脑（海马体：0.0753 ± 0.0114 vs. 小脑：0.0307 ± 0.0079，p = 0.0345）。
(B) 在慢病毒MJD小鼠模型中定量IPO8的免疫印迹，比较了注射编码27Q-Atxn3的慢病毒的一侧半球和注射编码72Q-Atxn3的对侧半球的蛋白裂解物；分析发现两种条件下的IPO8蛋白水平没有显著差异。
(C) 在与B相同的条件下注射慢病毒的MJD小鼠模型中，通过qRT-PCR定量Ipo8 mRNA，显示注射72Q的半球中IPO8的表达有增加的趋势（72Q：3.344 ± 1.083 vs. 27Q：1.000 ± 0.2297，p = 0.0671）。
(D) 对Wt和Tg 69Q小鼠的同窝幼崽进行免疫印迹分析，以量化小脑中的IPO8蛋白水平；与Wt同窝幼崽相比，Tg幼崽中的IPO8水平没有变化。
(E) 对Wt和69Q Tg小鼠进行qRT-PCR定量Ipo8 mRNA，显示69Q Tg小鼠中的Ipo8表达显著增加（Tg：1.800 ± 0.285 vs. Wt：1.000 ± 0.128，p = 0.034）；数值根据对照组平均值进行标准化，并以平均值±SEM显示。A项采用Tukey的事后检验进行单因素方差分析；B、C、D和E项采用配对t检验。?p < 0.05。

为了评估IPO8在MJD中的表达是否失调，我们量化了表达人类27Q和72Q-Atxn3的慢病毒诱导的MJD小鼠模型中纹状体中的IPO8表达差异，以及表达Tg 69Q的小脑中的IPO8表达差异。在量化慢病毒MJD模型中的IPO8水平时，我们观察到即使在蛋白质水平上没有变化（图2B），但在注射72Q-Atxn3的半球中，Ipo8 mRNA的表达也倾向于增加（图2C）。关于Tg 69Q小鼠模型，4个月大的Tg动物小脑中的IPO8蛋白与其Wt同窝幼崽相比也没有变化（图2D）。然而，在4个月大时，Tg动物小脑中的Ipo8 mRNA显著增加（图2E），这与慢病毒模型中的观察结果一致。总体而言，这些结果证实IPO8蛋白在成年小鼠大脑的不同结构中的表达存在差异，并且至少在mRNA水平上，其在MJD中的表达是失调的。

我们的结果显示，Ipo8的沉默可以减少体外Atxn3的聚集。我们进一步研究了这种保护作用是否在体内也能观察到，不仅防止Atxn3的聚集，还能防止神经元功能障碍和最终的神经元死亡。为此，我们使用了在纹状体中表达扩增的Atxn3的慢病毒MJD小鼠模型，并在不同半球同时注射编码shIPO8或shCTR的慢病毒（图3A）。然后比较了两个半球中的Atxn3聚集率和纹状体多巴胺以及CAMP调节的神经元磷酸蛋白32（DARPP-32）的表达，后者作为神经元功能障碍的标志物。我们观察到，与注射正常27Q形式的Atxn3的对侧半球相比，注射编码shIPO8的半球中Atxn3聚集体的数量显著减少（图3B）。此外，同一半球中神经元功能障碍标志物DARPP-32也显著保存，这表明Ipo8的沉默可以防止纹状体中神经元的丢失并维持其功能（图3C）。

我们的结果表明，Ipo8的沉默可以防止Atxn3的聚集并在体内改善神经元功能障碍。这些结果还表明，Ipo8的沉默可以在两种不同的MJD小鼠模型中减轻运动缺陷。我们还研究了Ipo8的沉默是否能在69Q转基因小鼠的小脑中保护神经元，这种小鼠模型以严重的小脑萎缩为特征。69Q转基因小鼠的小脑内注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒，然后使用甲苯紫染色来突出小脑结构并量化凝缩核的数量（图3D）。测量V叶区域时，观察到注射编码shIPO8的动物的小叶区域显著保留（图3E），表明其可能具有保护细胞的作用。此外，小脑中Ipo8被沉默的动物在深部小脑核（DCN）中的凝缩核数量显著减少，证明了其防止神经元丢失的能力（图3F）。这些结果表明，Ipo8的沉默在体内也具有神经保护作用，可以减少聚集形成，防止神经元功能障碍和神经退行性变。

Ipo8的沉默还被证明是减少小鼠纹状体和小脑MJD神经病理学特征的相关策略。为了研究神经病理学的恢复是否也能改善表型并延缓疾病进展，我们在Wt和69Q转基因小鼠中进行了体内行为测试，这些小鼠以严重的运动缺陷为特征。我们在小脑的三个区域（两个DCN和IX叶）注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒载体，以增强其治疗效果（Tg动物中的Ipo8沉默通过qRT-PCR得到验证，见图S6）。我们使用静态旋转棒测试分析了Wt动物的运动协调性和平衡能力，在注射前一天以及随后每三周进行一次，直到注射后12周。在整个实验过程中，Wt动物的表现没有差异，证明注射或小脑中shIPO8的表达没有毒性（图S7）。

我们在69Q转基因小鼠的小脑中注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒，以研究Ipo8的沉默是否也能在小脑中保护神经元。注射后8周，对小鼠进行了矢状切片分析和甲苯紫染色：选择两个不同的矢状平面进行研究：1 - 覆盖注射部位的小脑层测量（比例尺代表500 μm，相应放大图的比例尺代表100 μm）；2 - 覆盖DCN区域的切片用于计数凝缩核（比例尺代表100 μm，相应放大图的比例尺代表50 μm）。与对照组相比，注射shIPO8的动物的V叶区域显著保留（shIPO8：491621 ± 52755 μm2 vs. shCTR：349098 ± 29084 μm2，p = 0.0455）。注射shIPO8的动物与对照组相比，凝缩核的数量显著减少（shIPO8：4747 ± 298 vs. shCTR：5952 ± 427，p = 0.0494）。图中数值以平均值±SEM显示。B、C、E和F项采用配对t检验。?p < 0.05 和 ??p < 0.01；未配对t检验。

然后，我们研究了Ipo8的沉默是否能在69Q转基因小鼠的小脑中保护神经元，这种小鼠模型以严重的小脑萎缩为特征。注射shIPO8的69Q转基因小鼠小脑内注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒，使用甲苯紫染色来突出小脑结构并量化凝缩核的数量（图3D）。测量V叶区域时，观察到注射shIPO8的动物的小叶区域显著保留，表明可能存在细胞保护作用。此外，小脑中Ipo8被沉默的动物在深部小脑核（DCN）中的凝缩核数量显著减少，证明了其防止神经元丢失的能力（图3F）。这些结果表明，Ipo8的沉默在体内也具有神经保护作用，可以减少聚集形成，防止神经元功能障碍和神经退行性变。

Ipo8的沉默减轻了转基因小鼠模型中的运动缺陷。我们已证明Ipo8的沉默可以减少小鼠纹状体和小脑中的MJD神经病理学特征。为了研究神经病理学的恢复是否也能改善表型并延缓疾病进展，我们在Wt和69Q转基因小鼠中进行了体内行为测试，这些小鼠以严重的运动缺陷为特征。我们在小脑的三个区域（两个DCN和IX叶）注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒载体，以增强其治疗效果（Tg动物中的Ipo8沉默通过qRT-PCR得到验证，见图S6）。我们在注射前一天和之后每三周使用静态旋转棒测试分析了Wt动物的运动协调性和平衡能力，直到注射后12周。在整个实验过程中，Wt动物的表现没有差异，证明注射或小脑中shIPO8的表达没有毒性（图S7）。

我们在69Q Tg小鼠的小脑中注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒，使用甲苯紫染色来突出小脑结构并量化凝缩核（图3D）。测量V叶区域时，观察到注射shIPO8的动物的小叶区域显著保留（图3E），表明可能存在细胞保护作用。此外，小脑中Ipo8被沉默的动物在深部小脑核（DCN）中的凝缩核数量显著减少，证明其具有防止神经元丢失的能力（图3F）。这些结果表明，Ipo8的沉默在体内也具有神经保护作用，可以减少聚集形成，防止神经元功能障碍和神经退行性变。先前有报道称，IPO8可以促进转录因子p65（NF-kB复合物的p65亚基，也称为RelA）的核运输。NF-kB/p65是一种转录因子，在上游NF-kB通路被激活后，会运输到细胞核中，从而激活其他促炎细胞因子的转录。使用相同的表达72Q-Atxn3或27Q-Atxn3的N2a细胞模型，Ipo8沉默导致表达扩展型Atxn3的细胞中NF-kB/p65总蛋白水平显著下降（图5A）。在表达27Q型Atxn3的细胞中，这一效应较为轻微（图S10A和S10B）。图5显示Ipo8沉默可以降低NF-kB/p65蛋白水平，并阻止p-NF-kB/p65的核内穿梭。

**完整标题：**
Ipo8 silencing reduces NF-kB/p65 protein levels and prevents the nuclear shuttling of p-NF-kB/p65

**图例说明：**
(A) 免疫印迹检测72Q转染的N2a细胞中NF-kB/p65总蛋白水平，这些细胞同时转染了shIPO8或shCTR。在Ipo8沉默条件下，NF-kB/p65蛋白水平显著下降（shIPO8: 0.6178 ± 0.1093 vs. shCTR: 1.000 ± 0.0790，p = 0.0464）。
(B) 免疫印迹检测72Q转染的N2a细胞中NF-kB/p65总蛋白水平，这些细胞同时转染了LV-IPO8或LV-Empty（对照组）。统计分析显示在这些条件下NF-kB/p65蛋白水平没有显著差异。
(C) 对注射了shCTR或shIPO8编码慢病毒的69Q Tg和Wt小鼠的小脑（两侧的DCN和中央的IX-X小叶）进行免疫印迹分析。注射后12周收集的小脑样本用于定量Ser356磷酸化的NF-kB/p65的细胞质/核部分。
(D) 子细胞分离实验结果显示，与注射shCTR的Tg小鼠相比，注射shIPO8的69Q Tg小鼠的细胞质中p-NF-kB/p65含量没有变化，但其核部分中的磷酸化形式显著减少（Tg shIPO8: 0.5094 ± 0.1261；Tg shCTR: 1.151 ± 0.1887，p = 0.0326）。
(E) qRT-PCR定量注射了shCTR或shIPO8编码慢病毒的69Q Tg和Wt小鼠的小脑（两侧的DCN和中央的IX-X小叶）中NF-kB/p65 mRNA的水平。各组小鼠之间的NF-kB/p65表达水平没有显著差异。
(F) 对注射了shIPO8编码慢病毒的69Q Tg和Wt小鼠的小脑（两侧的DCN和中央的IX-X小叶）中Ipo8和NF-kB/p65 mRNA水平进行相关性分析，结果显示Wt（r = 0.9169；p = 0.0037）和69Q Tg小鼠（r = 0.8048；p = 0.0290）之间存在显著的正相关。数据在A、B、D和E中以平均值±标准误差表示，并在A、B和E中标准化到对照组的平均值。A和B使用配对t检验；D和E使用单因素方差分析及Tukey的事后检验；F使用皮尔逊相关性分析。*p < 0.05，**?p < 0.01。

**进一步研究：**
考虑到体内MJD模型可能更适合分析NF-kB通路的激活情况，我们进一步评估了NF-kB/p65第356位丝氨酸磷酸化形式的核质分布，这是最常研究的NF-kB/p65激活后的翻译后修饰。使用注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒的Wt和Tg小鼠进行研究（图5B，体内Ipo8沉默效率已在图S6中显示）。Tg小鼠的核中积累的p-NF-kB/p65量倾向于更多。重要的是，与Tg-shCTR小鼠相比，注射shIPO8的Tg小鼠的核部分中p-NF-kB/p65水平显著降低，接近Wt小鼠的水平（图5C和5D）。为了了解Ipo8沉默是否会在mRNA水平上降低NF-kB/p65的表达，我们在用于子细胞分离实验的相同样本中进行了qRT-PCR分析。尽管统计上不显著，但我们观察到注射shIPO8慢病毒载体的Wt和Tg小鼠的NF-kB/p65平均表达值均较低（图5E），且这与它们的Ipo8 mRNA表达水平呈正相关（图5F）。这些结果表明，Ipo8沉默可以在体外降低NF-kB/p65的总蛋白水平，甚至在体内的轻度沉默也会对NF-kB/p65表达产生显著且比例上的影响。此外，体内Ipo8沉默可以显著阻止S356磷酸化形式的NF-kB/p65向细胞核的转运。

**讨论：**
我们的结果表明，Ipo8沉默在MJD病理学和行为上的益处可能不是由于阻止了Atxn3的核积累，而是通过其他病理途径实现的。我们提出Ipo8沉默可能通过防止NF-kB相关神经炎症通路的过度激活来发挥作用。

**Ipo8调节Ago2蛋白水平：**
我们的结果提示，在MJD背景下，Ipo8的表达可能失调，因此也可能影响其相互作用伙伴的表达、功能和/或定位。前文已示，在Ipo8沉默时，NF-kB/p65的表达和定位会受到影响，这可能解释了在体外和体内模型中观察到的积极效果。然而，还发现了其他与Ipo8相互作用的伙伴，包括argonaute-2（Ago2）。IPO8-Ago2复合物的形成对于miRNA在细胞质中的招募和靶向特定mRNA是必要的。IPO8还被认为参与了Ago2介导的特定miRNA的核重入过程，从而调节其他miRNA的生物发生和功能，甚至它们自身的表达。这种成熟miRNA的运输也被报道是与Ago2组成的复合体共同完成的。

**进一步研究：**
我们使用表达72Q-Atxn3或27Q-Atxn3的N2a细胞模型发现，Ipo8沉默导致表达扩展型Atxn3的细胞中Ago2总蛋白水平显著增加（图6A）。在表达27Q型Atxn3的细胞中，这种效应较为轻微（图S16）。在同一细胞模型中，Ipo8过表达似乎对Atxn3的聚集率没有影响（图6B和S11）。

**结论：**
Ipo8沉默增加了Ago2蛋白水平（图6A），这一点在Apo2蛋白水平降低的条件下得到了验证（图6B）。我们对注射了shCTR或shIPO8编码慢病毒的69Q Tg和Wt小鼠的小脑进行了免疫印迹分析（图6C），结果显示Ipo8过表达条件下Ago2蛋白水平没有显著差异。

**后续研究：**
我们使用体内MJD模型评估了Ago2的核质分布，使用注射了编码shCTR或shIPO8的慢病毒的Wt和69Q Tg小鼠进行研究（图6C）。注射shIPO8后，Wt和Tg小鼠的核中Ago2水平均未显著下降（图6C和6D）。我们的研究表明，Ipo8沉默在MJD病理学和行为上的益处也可能与Ago2水平的增加有关，而Ago2水平在MJD模型中确实被报道为降低，因此可能促进了重要的miRNA处理途径。

**讨论：**
在本研究中，我们提供了证据表明核质运输蛋白IPO8调节Atxn3的聚集和MJD病理学。具体来说，Ipo8下调在MJD的细胞和动物模型中防止了Atxn3的聚集，从而改善了由PolyQ扩展引起的神经病理功能障碍和共济失调表型。然而，需要进一步研究以阐明IPO8影响Atxn3聚集的确切分子机制。我们的发现表明，Ipo8调节NF-kB/p65向细胞核的运输以及Ago2的表达和转运，从而间接有助于改善MJD的发病机制。该研究还发现，IPO8蛋白水平在成年小鼠大脑的不同区域存在差异。先前的研究已确定IPO8在小鼠胚胎发育期间存在于大脑中，强调了其在小鼠大脑皮层发育中的功能重要性，但对其在成年大脑中的功能知之甚少。如Human Protein Atlas、GTEx和Allen等数据库所描述的，IPO8在成年大脑中的表达普遍存在且水平较低，区域特异性不强。尽管存在区域差异，但我们发现IPO8在整个大脑中的蛋白水平相对较低。鉴于小脑是MJD中最受影响的脑区之一，并且其IPO8表达水平较低，因此探讨IPO8表达与MJD发病机制之间的潜在直接关联是合理的。在未来的研究中，我们将检测健康人和MJD患者的脑样本中的基础和区域IPO8表达情况。

**重要提示：**
在慢病毒和69Q转基因MJD模型中，分别观察到纹状体和 cerebellum中IPO8 mRNA水平的增加，而蛋白水平保持不变。一种可能的解释是，除了IPO8 mRNA水平升高外，它可能被捕获在mRNA处理结构中，如应激颗粒或P颗粒。这些结构已被报道长期存在，并参与了多种神经退行性疾病的病理生理过程。在Tg小鼠中，与野生型小鼠相比，IPO8蛋白的周转率可能增加，或者某些与病理更相关的IPO8蛋白异构体可能无法在其预期的全长分子量下被检测到。需要进一步研究以理解这一现象，并调查IPO8 mRNA失调的潜在原因，以及最终IPO8蛋白水平失调的原因。

**最终结论：**
我们的体内MJD病理学数据表明，Ipo8沉默可以减少Atxn3的聚集并防止神经元功能障碍和死亡。这些参数在两种MJD模型中得到了验证：一种是在纹状体中表达扩展全长Atxn3的慢病毒模型，其中防止了功能障碍和DARPP-32阳性细胞的丢失；另一种是在小脑中表达扩展截短型Atxn3的69Q转基因模型，其中观察到小脑萎缩的改善和凋亡细胞数量的减少。对69Q转基因小鼠的行为分析显示，小脑中Ipo8沉默的小鼠运动表现和步态有显著改善。这些发现表明，在MJD受影响的脑区减少Ipo8表达可能是一种有前景的策略，可以延缓疾病的发作和进展。我们的下一步将采用更符合MJD病理学的临床相关模型——YAC84Q小鼠模型。该模型表达了人类Atxn3的全长序列，包括其内源性调控元件，从而提供了一个更好的平台来阐明Ipo8沉默在MJD发病机制中的分子机制。

**后续研究方向：**
我们进一步探讨了IPO8是否直接参与Atxn3通过核膜的运输。如前所述，本研究的结果表明并非如此。在Ipo8下调的情况下，Atxn3的定位保持不变，表明观察到的聚集水平降低并不依赖于Atxn3的定位（如其他运输蛋白的情况）。基于这些观察结果，我们推测IPO8可能参与其他蛋白质货物的运输，这些运输蛋白可能影响蛋白质质量控制机制、蛋白质聚集的清除或其他基因的转录调控。然而，目前的研究仍不能排除IPO8与Atxn3之间存在直接相互作用的可能性。未来关于蛋白质-蛋白质相互作用的研究将进一步探索这种可能性。正如之前的文献所记载的，IPO8可能参与了NF-kB复合体中p65亚单位（也称为RelA）的核运输。NF-κB是一类可诱导的转录因子，它们调控着与免疫和炎症反应相关的大量基因。NF-κB/p65转录因子（与其他NF-κB亚单位复合）在细胞质中通过与抑制因子IκB结合而处于非活跃状态。当被激活时，IκB会被降解，从而允许p65发生磷酸化，并促进其向细胞核内转移，在那里它与其他促炎基因的启动子区域结合。先前的研究已经表明NF-κB信号通路参与了MJD的发病机制。Ashraf及其同事发现多个基因参与了NF-κB信号通路，这些基因调节Atxn3蛋白的表达，进而影响疾病病理。我们团队最近也建立了NF-κB/p65磷酸化状态改变与MJD之间的有趣联系。在这项研究中，我们证明Ipo8的沉默不仅降低了细胞中NF-κB/p65的总蛋白水平，还显著减少了其Ser356磷酸化形式向细胞核的转移，达到了与野生型（Wt）动物相似的水平。之前对MJD果蝇模型的研究已经报告，在星形胶质细胞中选择性抑制Relish（NF-κB的果蝇同源物）可以防止由扩展型Atxn3表达引起的神经元退化，并延长这些动物的寿命。这一发现表明炎症过程是MJD病理的重要组成部分。我们团队随后的研究表明，通过给予布洛芬减轻神经炎症可以诱导神经保护作用，从而缓解MJD相关的神经病理和运动障碍。这一发现支持了预防神经炎症是延缓疾病进展的有效治疗策略的假设。尽管如此，仍需进行进一步的实验来详细研究IPO8在NF-κB信号通路和MJD中的机制性因果效应。

为了进一步证实IPO8下调对神经炎症的影响，未来的研究将包括评估指示星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的标志物。为此，将使用84Q YAC转基因小鼠模型，并结合编码shIPO8的AAV载体，以实现沉默序列的更广泛和持续表达。这种实验策略将为检测随着MJD特征性进展而加剧的神经炎症环境中的变化提供更适宜的条件。已有文献记载IPO8在miRNA的定位和功能中起作用。IPO8与Ago2结合，将miRNA靶向到它们的mRNA目标上，引导这些mRNA进入mRNA处理体（p-body）或将其转移到细胞核空间，在那里一些mRNA被认为可以发挥作用。我们的研究结果表明，在体外沉默Ipo8还可以增加Ago2的表达水平。之前有报道称，在69Q转基因小鼠模型中Ago2表达下调。因此，假设Ipo8的沉默可以通过恢复Ago2的表达水平并可能重新建立正常的mRNA沉默活性来产生有益的神经病理和行为效应。关于Ago2的核质转移，我们的发现尚无定论，因为没有达到统计学显著性。需要进行后续研究来进一步探讨Ago2亚细胞定位对正常和MJD细胞功能的影响。

如图7所示，概述了可能有助于我们在疾病模型中观察到的IPO8介导的有益效应的机制。

在MJD中，IPO8 mRNA过表达，IPO8蛋白可能促进了NF-κB/p65磷酸化形式向细胞核的转移，激活了其他促炎基因的表达，加剧了Atxn3的聚集和疾病病理。此外，据报道在MJD中Ago2表达下调。当沉默IPO8时，NF-κB/p65的总表达减少，其磷酸化形式向细胞核的转移也减少，可能防止了NF-κB通路的过度激活。IPO8的沉默还增加了Ago2蛋白水平，可能抵消了疾病情况下观察到的下调效应。这两种机制都可以在MJD模型中解释到IPO8沉默后Atxn3聚集和疾病进展的改善。

对当前工作的全面回顾揭示了研究MJD神经病理学分子基础的新视角，强调了IPO8作为疾病发病机制多个方面的新干预因素的重要性。这项工作表明，抑制Ipo8似乎是通过防止Atxn3聚集和与疾病相关的炎症过程的加剧来延缓MJD进展的有效策略。因此，我们的研究为识别新的MJD治疗靶点提供了重要见解，这些靶点有可能推广到其他神经退行性疾病。

虽然这项研究确立了IPO8作为MJD中Atxn3聚集的关键调节因子，但仍需解决几个限制因素以充分阐明其治疗潜力。主要限制之一是缺乏IPO8与Atxn3之间直接蛋白质-蛋白质相互作用的明确证据；目前尚不清楚观察到的聚集减少是它们相互作用的直接结果，还是通过其他蛋白质货物的运输介导的次要效应。具体来说，虽然我们的发现表明IPO8调节NF-κB/p65信号通路和Ago2的表达，但确切的因果机制和Ago2亚细胞定位的功能影响需要进一步研究以达到统计和机制上的清晰。此外，依赖于慢病毒和截短的69Q转基因模型需要在更生理上具有代表性的平台上进行验证，例如更好地模拟人类MJD神经病理的YAC84Q小鼠模型。完成这些分子细节并确认人类MJD脑样本中的区域蛋白表达模式将是将这些见解转化为可行的临床策略以延缓疾病进展的关键步骤。

**资源可用性**
**联系人**：Luís Pereira de Almeida ([e-mail]; CNC-科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心, Rua Larga, Coimbra 3004-504, 葡萄牙)

**材料可用性**
本研究中生成的所有独特/稳定的试剂可在完成材料转让协议后从联系人处获得。

**数据和代码可用性**
• 数据：本文报告的数据将在请求时由联系人共享。
• 代码：本文未报告原始代码。
• 其他项目：重新分析本文报告的数据所需的任何额外信息可向联系人请求。补充数据和方法的列表可在以下Mendeley Data中找到：https://data.mendeley.com/datasets/s2ng8g5745/1

**致谢**
欧洲委员会第七框架计划FP7/2010下的TreatPolyQ项目 - 项目编号264508 (TS, LPA)。联邦教育和研究部 - PPPT-MJD项目编号01GM1309B (LPA)。COMPETE 2020 - 竞争力行动计划，以及国家基金 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - BrainHealth2020项目编号CENTRO-01-0145-FEDER-000008 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - UID/NEU/04539/2020 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - ViraVector项目编号CENTRO-01-0145-FEDER-022095 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - CortaCAGs PTDC/NEU-NMC/0084/2014 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - SpreadSilencing项目编号POCI-01-0145-FEDER-029716 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - Imagene项目编号POCI-01-0145-FEDER-016807 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - CancelStem项目编号POCI-01-0145-FEDER-016390 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - POCI-01-0145-FEDER-032309 (LPA)。欧盟联合项目-神经退行性疾病研究 (JPND) – SynSpread (LPA)。欧盟联合项目-神经退行性疾病研究 (JPND) – ESMI (LPA)。欧盟联合项目-神经退行性疾病研究 (JPND) ModelPolyQ (LPA)。欧盟联合项目-神经退行性疾病研究 (JPND) – NEURODIET (TS)。E-Rare4/0003/2012欧盟罕见病研究项目联合呼吁JTC 2012 (LPA)。德国联邦教育和研究部 (BMBF, E-Rare项目编号SCA-CYP, 项目编号01GM1803; EuSAge项目编号01DN18020; ELAPSE-ND项目编号01DN23016) (TS)。美国国家共济失调基金会 (TS, LPA)。美国葡萄牙生物医学研究基金会 (APBRF, LPA)。Richard Chin和Lily Lock Machado-Joseph疾病研究基金会 (LPA)。UID/04539/2025。LA/P/0058/2020 (LPA)。科学技术基金会 (FCT) - 博士奖学金 - PD/BD/114171/2016 (IMM)。欧盟通过HORIZON协调和支持行动的资助：GeneT-基因治疗卓越中心葡萄牙团队项目编号ID:101059981，GeneH卓越中心编号ID:101186939，GCure Era主席编号ID:101186929。我们感谢科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心（MICC-CNC）的显微镜成像中心在图像采集方面的帮助和指导，以及Rosário Faro博士在分子生物学技术方面的技术支持。

**作者贡献**
概念化：T.S., L.P.A., 和 I.M.M.；方法学：T.S., L.P.A., I.M.M., 和 A.S.S.；研究：I.M.M., A.S.S., D.R.R., D.D.L., K.L., A.V.F., 和 D.P.；监督：T.S. 和 L.P.A.；资金：T.S., L.P.A., 和 O.R.；写作：I.M.M.；手稿修订：I.M.M., A.S.S., D.R.R., D.D.L., K.L., A.V.F., D.P., O.R., T.S., 和 L.P.A.

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**在写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况**
在准备这项工作时，作者使用了DeepL和Google Gemini来提高语言表达和可读性。使用这些工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。

**STAR**

**方法**
**关键资源表**
**试剂或资源**
**来源标识符**
抗Ataxin-3单克隆抗体（克隆1H9）：Merck Millipore，Cat# MAB5360；RRID: AB_2129339
抗Importin-8抗体：Santa Cruz，Cat# sc-398854；无RRID
Beta-actin，克隆AC-74：Sigma-Aldrich，Cat# A5316；RRID: AB_476743
GAPDH：Merck Millipore，Cat# MAB374；RRID: AB_210744
抗DARPP32抗体：Merck Millipore，Cat# AB10518；RRID: AB_108070
Nf-kB/p65，F-6：Santa Cruz，Cat# sc-8008；RRID: AB_628017
phospho Nf-kB/p65：Invitrogen，Cat# MA5-15160；RRID: AB_1098307
Ago-2：Cat# 2897；RRID: AB_209629

**补充方法中提到的其他抗体和稀释度**
请参见补充数据中的表S2。

**化学品、肽和重组蛋白**
Attractene转染试剂：Qiagen，Cat# 301005
聚乙二醇亚胺（PEI，MW40000）：Polysciences，Cat# 24885
PrestoBlue细胞活力试剂：Thermo Fisher，Cat# A13261

**关键商业试剂**
亚细胞蛋白分级试剂盒：Thermo Fisher，Cat# 87790
NucleoSpin RNA Mini试剂盒：Macherey-Nagel，Cat# 740955.50

**补充数据和原始数据**
本文数据：https://data.mendeley.com/datasets/s2ng8g5745/1
论文DOI：https://doi.org/10.17632/s2ng8g5745.1

**实验模型**
**细胞系**
HEK-293T：ATCC，Cat# CRL-3216；RRID: CVCL_0063
小鼠神经母细胞瘤（N2a）：ATCC，Cat# CCL-131；RRID: CVCL_0470

**实验模型：生物体/品系**
小鼠：C57BL/6J：Charles River
N/
小鼠：Tg 69Q（Machado-Joseph疾病模型）：在科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心建立菌落

**寡核苷酸**
shIPO8_1（寡核苷酸对）：参见补充数据中的表S2
shIPO8_2（寡核苷酸对）：参见补充数据中的表S2

**qRT-PCR引物（人/鼠）**
参见补充数据中的表S4和S5

**重组DNA**
质粒：p-ENTR/pSUPERAddGene，Cat# 575-1；RRID: Addgene_575-1
质粒：SIN-cPPT-PGK-EGFP-WHV-LTR（Gateway目标载体）：本研究所描述
质粒：pEGFP-N2-148Q-Atxn3：之前有描述
质粒：pCMV-SPORT6-IPO8：Horizon，Cat# OHS5893-202503637
质粒：pCMV-SPORT6-TruncIPO8：Horizon，Cat# MHS1010-202699950
质粒：PGK-72Q-Atxn3：之前有描述
质粒：PGK-27Q-Atxn3：之前有描述
质粒：LV-PGK-72Q-Atxn3：之前有描述
质粒：LV-PGK-EGFP-H1-shCTR：本研究所描述
质粒：LV-PGK-EGFP-H1-shIPO8：本研究所描述

**软件和算法**
GraphPad Prism：https://www.graphpad.com/
Image Studio软件：https://www.licorbio.com/image-studio
Zen Lite Blue Edition：Zeiss Microscopy，https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/software/zeiss-zen-lite.html
CellProfiler：Broad Institute
BioRender：https://www.biorender.com/

**实验模型和参与者详情**
HEK-293T细胞在37°C和5% CO2的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，外加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%非必需氨基酸。小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）在37°C和5% CO2的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，外加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。为了获得稳定表达pEGFP-N2-148Q-Atxn3的HEK-293T细胞系（数据来自补充部分），按照先前的描述用FACS对细胞进行分选。这两种细胞系均从ATCC获取并经过认证，并在我们的设施中定期检测支原体。

**动物模型**
对于MJD慢病毒模型，在5周龄时将4周大的C57BL/6雌性和雄性小鼠注射到纹状体。对于小脑注射、神经元功能障碍分析和行为分析，使用5周大的C57Bl/6背景转基因（Tg）69Q小鼠和同龄的野生型（Wt）小鼠，如前所述。这种69Q小鼠模型在小脑的浦肯野细胞中表达69Q截短的ataxin-3。69Q Tg小鼠的菌落是在科英布拉大学神经科学与细胞生物学中心建立的，并按照补充方法中的描述进行基因分型。小鼠在常规的12小时光暗周期下饲养，室温可控，食物和水自由提供。对于这两种模型，都使用了雌性和雄性动物，并选择实验组以保持胎仔数量和雄性/雌性比例尽可能均衡。实验按照欧盟委员会（2010/63/EU）关于实验室动物照料和使用的指令进行，并得到了科英布拉大学医学院和神经科学与细胞生物学中心的动物福利负责组织（ORBEA_66_2015/22062015和ORBEA_289_2021/10122021）的批准。研究人员接受了充分的培训（根据FELASA标准），并获得了来自葡萄牙当局（里斯本食品和兽医总署）的认证，以执行这些实验。所有努力都旨在将动物所受的痛苦降到最低。

### 方法细节
- **siRNA和shRNA设计**：使用了esiRNA（内切核糖核酸酶制备的siRNA）技术来抑制目标NTPs的表达。siGFP（EHUEGFP，Sigma）用于在HEK-293T细胞中测试效率，而siCRM1、siTNPO1、siIPO13和siKPNA3则用于目标选择性的验证。针对34种不同人类运输蛋白的siRNA列表见表S1，该列表基于科学界已知的最新核质运输蛋白清单。siRNA靶向荧光素酶被用作对照组。进一步的研究使用了靶向人类IPO8的siRNA。
- **关于shRNA**：生成了一种非靶向的短发夹RNA（shCTR）以及两种靶向小鼠Ipo8 mRNA的shRNA（shIPO8_1和shIPO8_2）。每种shRNA都设计了一对寡核苷酸，其序列见表S3。每对寡核苷酸经过退火处理后插入到线性化的p-ENTR/pSUPER载体中。随后通过LR克隆酶重组系统将H1-shRNA cassette转移到SIN-cPPT-PGK-EGFP-WHV-LTR载体中。shRNA测试的详细信息见图S12。选择shIPO8_2进行后续实验。

### 过滤捕获和分层协议
- **对于HEK-293T细胞**：将1.5x10^5个细胞接种在六孔板中，24小时后使用Attractene Transfection Reagent转染1 μg的pEGFP-N2-MJD148 Atxn3和1 μg的siRNA。
- **过表达研究**：148Q-Atxn3与1 μg的全长表达人类IPO8一起转染，后者通过Gateway克隆技术克隆到pCMV-SPORT6载体中，或者克隆到pCMV-SPORT6-TruncIPO8载体中。
- **对于N2a细胞**：将2x10^5个细胞接种在六孔板中，24小时后使用1 mg/mL的polyethylenimine转染1 μg的PGK-72Q-Atxn3和1 μg的shRNA。所用质粒的示意图见图S13。转染后72小时，收集细胞并置于含有cOmpleteTM Mini蛋白酶抑制剂的1x磷酸盐溶液（PBS）中，超声波处理30秒，然后根据制造商的说明使用Bradford试剂进行蛋白质定量。过滤捕获使用醋酸纤维素膜和相应的设备进行。分层协议按照之前的方法进行，并 adapt 以使用相同的蛋白质样本（见图S14）。
- **检测方法**：使用anti-Atxn3, 1H9一抗和anti-mouse IgG, IRDYE 680RD二抗来检测过滤膜。膜的使用和定量通过Odyssey Fc Imager和Image Studio软件完成。

### 基因表达
- **总RNA提取**：使用NucleoSpin RNA, Mini试剂盒按照制造商的说明提取小鼠样本的总RNA。
- **cDNA制备**：通过iScript cDNA合成试剂盒将总RNA转化为cDNA。
- **qRT-PCR**：在StepOne Plus Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）和SsoAdvanced SYBR Green Supermix（Bio-Rad）中进行qRT-PCR。使用ProbeFinder工具版本2.53（Roche）设计针对小鼠Ipo8 cDNA的引物。使用Hprt cDNA进行样本标准化。
- **反应条件**：95°C预热30秒，然后进行45个循环：每个循环95°C 5秒、58°C 30秒。每个目标的扩增率通过循环阈值（Ct）数值评估，差异使用2-ΔΔCt方法计算。

### 免疫印迹分析
- **HEK-293T细胞**：将1.50x10^5个细胞接种在六孔板中，24小时后使用Attractene Transfection Reagent转染1 μg的选定siRNA。转染后72小时收集细胞，置于含有cOmpleteTM Mini蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中（缓冲液组成：50 mM Tris-base; 150 mM NaCl; 5 mM EGTA; 1% Triton X-100; 0.5% sodium deoxycholate; 0.1% SDS）。蛋白质定量按照制造商的说明使用Bradford试剂进行。
- **N2a细胞**：将2.0x10^5个细胞接种在六孔板中，24小时后使用PEI（MW40000, Polysciences）转染1 μg的PGK-72Q或27Q-Atxn3和1 μg的shRNA。转染后72小时收集细胞，置于含有cOmpleteTM Mini蛋白酶抑制剂和0.2 mM PMSF、1 mM DTT、1 mM Sodium Orthovanadate及5 mM Sodium Fluoride的RIPA缓冲液中。免疫印迹按照之前的方法进行，膜的使用和定量通过Odyssey Fc Imager和Image Studio软件完成。

### 慢病毒载体生产
- **慢病毒载体（Lv）**：使用四质粒系统在HEK-293T细胞系中生产编码人类突变ATXN3（LV-PGK-72Q-Atxn3）的慢病毒载体、负性shRNA（LV-PGK-EGFP-H1-shCTR）以及靶向小鼠Ipo8 mRNA的shRNA（LV-PGK-EGFP-H1-shIPO8）。
- **病毒颗粒回收与浓度检测**：慢病毒颗粒重新悬浮在0.5% BSA的无菌1x PBS中，并通过ELISA检测HIV-1 p24抗原水平进行浓度测定。浓缩的病毒库存储存在-80°C直至使用。通过立体定向注射到纹状体中确认转基因表达并评估毒性（见图S4），并通过qRT-PCR检测小鼠Ipo8 mRNA水平（见图S6）。

### 立体定向注射
- **纹状体和小脑注射**：对5周大的小鼠进行麻醉（酮胺75 mg/kg + medetomidine 1 mg/kg），手术后使用Antipamezol（2.5 mg/kg）逆转麻醉效果。对于Wt小鼠的纹状体注射，将400 ng编码72Q Atxn3的慢病毒与400 ng编码shCTR或shIPO8的慢病毒混合（总体积2 μL），以以下坐标进行立体定向注射：前后的距离为0.6 mm，左右距离为±1.8 mm，垂直距离为3.3 mm。对于Wt小鼠的小脑注射，在Lobule V-VI区域以以下坐标进行立体定向注射：前后距离为-2.4 mm，左右距离为0 mm，垂直距离为-2.9 mm。对于69Q转基因小鼠，注射坐标为：前后距离为-2.3 mm，左右距离为0 mm，垂直距离为-3.0 mm。
- **行为分析**：对Wt小鼠的小脑注射3次，每次400 ng的shCTR或shIPO8慢病毒（总体积6 μL），注射坐标如下：DCN区域前后距离为-6.5 mm，左右距离为±0.75 mm，垂直距离为-2.1 mm；Lobule IX区域前后距离为-7.75 mm，左右距离为0 mm，垂直距离为-3.5 mm。

### 组织学处理
- **小鼠麻醉与固定**：小鼠通过过量注射酮胺（75 mg/kg）和medetomidine（1 mg/kg）进行麻醉。随后进行心穿灌流和4%戊二醛（PFA）固定。大脑收集后置于4% PFA中固定24小时，再浸泡在30%蔗糖/PBS缓冲液中冷冻保存。对纹状体进行立体定向注射的小鼠，使用冷冻切片机切割25 μm厚的冠状切片。对于小脑注射的小鼠，使用相同设备和条件切割30 μm厚的矢状切片。所有切片保存在含1x PBS和Na azide的48孔板中，以便进行自由浮动的免疫组织化学实验。

### 组织学分析
- **免疫组化**：对注射了编码72Q-Ataxin和shCTR/shIPO8的Wt小鼠的纹状体进行彩色免疫组化分析。对Wt和Tg小鼠的小脑进行crystal violet染色。组织学程序、所用抗体以及定量分析的详细信息见补充方法部分。所有组间的等效切片在相同条件和标准下进行评估和处理/成像。
- **行为测试**：对雌性和雄性5周大的小鼠从注射前一天开始进行一系列运动测试，每周测试一次，持续到注射后12周。所有测试在黑暗环境中进行，并确保每只小鼠在相同的时间段内（即小鼠的黑暗时间）完成。

### 旋转木棒测试
- **使用设备**：Letica Scientific Instruments公司的LE 8200型旋转木棒装置（Panlab，巴塞罗那，西班牙）。
- **实验步骤**：小鼠以恒定速度（5 r.p.m.）在旋转木棒上运行，记录其运行时间。

### 游泳测试
- **实验设置**：小鼠放置在一个长70 cm、高20 cm、宽15 cm的水族箱边界上，水族箱底部上方9 cm处设有一个长7 cm、宽6 cm的平台。水族箱内的水温度控制在24°C–26°C。记录小鼠到达平台所需的时间，每次测试间隔至少30分钟，共进行三次试验。

### 足迹测试
- **实验方法**：小鼠的后爪和前爪分别涂上红色和蓝色无毒涂料。让小鼠在 height 为15 cm 的装置内的100 × 10 × 15 cm空白纸上行走。每次测量从一个脚步到下一个脚步的平均距离作为步长。完美对齐的情况记为0（即后脚印中心与前脚印中心重合）。如果脚印不重合，则记录两个脚印中心之间的距离。

### 核质分层
- **样本选择**：从Wt和69Q Tg小鼠中选择小脑样本，使用Subcellular Protein Fractionation Kit进行核质分层分析。

### cDNA合成与NTP mRNA定量
- **总RNA提取**：使用Qiagen公司的RNAeasy试剂盒按照制造商的说明提取总RNA。
- **cDNA逆转录**：使用QuantiTect逆转录试剂盒将总RNA转化为cDNA，并储存在-20°C。
- **实时PCR**：使用StepOne Plus Real-Time PCR系统和SsoAdvanced SYBR Green Supermix（Bio-Rad）进行实时定量PCR。引物设计使用ProbeFinder工具版本2.53（Roche）。Hprt cDNA用于样本标准化。反应条件为：95°C预热30秒，随后进行45个循环：每个循环95°C 5秒、58°C 30秒。扩增率通过Ct值计算，差异使用2-ΔΔCt方法确定。

### 免疫印迹
- **细胞接种**：将1.50x10^5个HEK-293T细胞接种在六孔板中，24小时后使用Attractene Transfection Reagent转染1 μg的选定siRNA。
- **样本收集**：转染后72小时收集细胞，置于含有cOmpleteTM Mini蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中。
- **免疫印迹**：使用Odyssey Fc Imager和Image Studio软件进行分析。

### 结果展示
- **所有抗体及稀释比例**：所有用于免疫染色的抗体及其稀释比例列在关键资源和表S3中。基因表达水平被标准化为PDH、β-actin和YWHAZ这些管家基因的表达水平。

**免疫组化**
在用0.1%苯基肼/PBS阻断内源性过氧化物酶后，将松散的切片置于含有0.1% Triton X-100和10%正常山羊血清的1% PBS封闭液中孵育。随后，将切片在4°C下用初级抗体封闭过夜：小鼠单克隆抗Atxn3抗体（1H9；1:5000；#5360 Merck Millipore）、兔抗多巴胺和环腺苷酸调节的神经元磷酸蛋白32（DARPP32）抗体（1:1000；AB#10518 Merck Millipore）；接着用相应的生物素标记的次级山羊抗小鼠或抗兔抗体（1:250；Vector Laboratoires）孵育。通过使用VECTASTAIN ABC试剂盒和3′,3′-二氨基联苯胺四氯化物（DAB金属浓缩物；Pierce）作为底物来可视化结合的抗体。然后将切片安装在明胶涂层的载玻片上，分别用70%、96%和100%乙醇脱水3分钟，再用二甲苯溶液脱水5分钟，最后使用EprediaTM安装介质（Fisher Scientific，编号4112）进行安装。小鼠切片的免疫反应性按照先前的方法进行分析。使用Zeiss Axio Imager 2和AxioVision 4.7软件包（Carl Zeiss Microimaging）来可视化染色结果。

**细胞活力检测**
HEK-293T细胞以每孔1×10^4个细胞的密度接种在96孔板中，24小时后使用Attractene转染试剂（Qiagen）按照制造商的说明转染0.1 μg pEGFP-N2-MJD148和0.1 μg siRNA。转染72小时后，用预热的1x PBS清洗细胞，并按制造商的说明将细胞与PrestoBlue?细胞活力试剂（Life Technologies）以1:10的比例稀释后，在37°C下孵育10分钟。使用Synergy HT微孔板读取器，在530 nm激发波长和25 nm带宽下读取荧光值，同时在590 nm和35 nm带宽下读取发射值。

**定量和统计分析**
通过Student’s t检验或ANOVA（单因素或双因素）确定统计显著性，随后使用GraphPad Prism进行适当的事后检验。所有图表中均显示了单个数据点以确保透明度。结果表示为平均值±标准误差（SEM）。显著性阈值设定为p < 0.05（?）、p < 0.01（??）和p < 0.001（???），并在图例描述中指明了p值。

**补充信息（1）**
PDF文件（12.34 MB）
文档S1。包含图S1–S16和表S1–S5。