迷走神经传入刺激减轻LPS诱导的急性肺部炎症与脾脏重量减轻及肺部CellTrace阳性信号增加相关

《Agronomy》：Vagal Afferent Stimulation Attenuates LPS-Induced Acute Lung Inflammation in Association with Reduced Spleen Weight and Increased CellTrace-Positive Signals in the Lung

　　

迷走神经传入刺激通过涉及交感神经系统(SNS)和脾脏的神经免疫途径发挥强大的抗炎作用。然而，迷走神经传入刺激如何影响炎症组织中的脾脏反应和CellTrace阳性信号仍不清楚。在本研究中，研究人员探究了迷走神经传入电刺激对小鼠气管内脂多糖(LPS)诱导的脾脏反应和急性肺部炎症的影响。作为一种预处理干预，aVNS在LPS给药前24小时应用于右侧颈部迷走神经。通过测量支气管肺泡灌洗液(BALF)中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平来评估肺部炎症。通过测量脾脏重量来评估脾脏反应，并在直接脾内注射CellTrace? Far Red后评估CellTrace阳性信号。aVNS显著降低了LPS给药后的BALF TNF-α水平（假手术组：5443 ± 404 pg/mL，n = 5；aVNS组：2891 ± 756 pg/mL，n = 5）。此外，aVNS在刺激24小时后降低了脾脏重量。进一步研究发现，aVNS + LPS组中CellTrace Far Red阳性细胞的比例显著高于假手术 + LPS组（0.00504 ± 0.00056 vs. 0.00151 ± 0.00017，每组n = 4）。这些发现表明，迷走神经传入刺激降低了对LPS的BALF TNF-α反应，并与脾脏重量减轻和肺切片中检测到的CellTrace阳性信号增加相关。这些观察结果表明，脾脏和免疫细胞动力学的变化可能伴随迷走神经传入刺激的抗炎作用。

急性肺部炎症是全球范围内导致发病和死亡的主要原因，会引发呼吸衰竭和急性呼吸窘迫综合征。虽然炎症反应对宿主防御至关重要，但过度的炎症会导致严重的组织损伤并恶化临床结果。因此，识别调节炎症反应的内源性机制成为重要研究目标。研究表明，神经系统在调节免疫功能和炎症中发挥关键作用，特别是迷走神经通路。迷走神经传入电刺激(aVNS, 激活迷走神经传入纤维的电刺激方法)通过涉及孤束核、延髓C1神经元和交感神经系统(SNS, 调节机体应激反应的自主神经系统)的神经回路，产生强大的抗炎和器官保护作用。这一通路不同于经典的迷走神经传出胆碱能抗炎通路，主要涉及下游交感和儿茶酚胺能信号。交感神经末梢释放的去甲肾上腺素或肾上腺髓质分泌的肾上腺素可激活脾脏免疫细胞，从而抑制过度的炎症反应，脾脏在此过程中作为关键的下游效应器官。然而，目前尚不完全清楚脾脏免疫细胞如何具体介导这种抗炎效应。特别是，迷走神经传入通路的激活是否改变脾脏免疫细胞动力学，并促进脾脏来源的免疫细胞动员至炎症部位，仍缺乏直接证据。

为此，研究人员在脂多糖(LPS, 诱发炎症反应的细菌内毒素)诱导的小鼠急性肺部炎症模型中，研究了aVNS与脾脏反应之间的关系。研究人员检验了aVNS是否改变脾脏大小以反映脾脏免疫细胞动力学的变化，并通过向脾脏直接注射荧光示踪剂，检验aVNS是否改变炎症肺组织中检测到的CellTrace阳性信号。研究得出结论，aVNS能够减轻LPS诱导的急性肺部炎症，且该作用与脾脏重量减轻以及肺部CellTrace阳性信号增加相关。这项研究发表在《Agronomy》期刊上，其研究结果为连接神经刺激与外周抗炎保护的细胞机制提供了新的见解，具有重要的学术意义。

关键技术方法方面，样本队列来源为8周龄雄性C57BL/6J小鼠（共31只，购自Sankyo Labo Service Corporation）。研究人员将aVNS作为预处理，在LPS给药前24小时应用于右侧颈部迷走神经。随后气管内滴注LPS诱导急性肺部炎症，采集支气管肺泡灌洗液(BALF, 采集肺部因子的液体)以测量肿瘤坏死因子-α(TNF-α, 一种促炎细胞因子)水平评估肺部炎症。通过称重评估脾脏反应。为追踪细胞，将CellTrace? Far Red直接注射至脾脏实质内，随后收集肺组织进行固定与切片，利用荧光显微镜对肺组织中CellTrace阳性信号进行定量分析。采用t检验和方差分析(ANOVA)处理数据。

研究结果部分包含以下几个小节：
3.1. aVNS Attenuated LPS-Induced Acute Lung Inflammation
研究人员首先设置了aVNS的实验装置，并在aVNS后24小时通过气管内滴注LPS诱导急性肺部炎症。通过测量BALF中的TNF-α浓度，研究发现aVNS组小鼠的TNF-α浓度显著低于假手术组。这表明aVNS能够有效减弱LPS诱导的急性肺部炎症。

3.2. aVNS Reduces Spleen Weight 24 h After Stimulation
为了探究aVNS是否改变脾脏反应，研究人员在刺激后24小时收集脾脏。通过肉眼观察和定量分析发现，aVNS组小鼠的脾脏明显小于假手术组，且脾脏重量显著降低。两组小鼠的体重没有显著差异。因此，经体重标准化后的脾脏重量在aVNS后也显著降低。

3.3. aVNS Increases CellTrace-Positive Objects Detected in Lung Sections
为检验aVNS是否影响肺组织中的CellTrace Far Red阳性信号，研究人员在电刺激前向脾脏内直接注射了CellTrace? Far Red。通过对肺切片的荧光图像进行定量分析，结果显示，仅接受aVNS的小鼠肺部Far Red阳性细胞数量较少。而在接受aVNS并给予LPS处理的小鼠中，Far Red阳性细胞数量显著增加，相比之下，假手术后给予LPS的小鼠肺部标记细胞较少。经DAPI衍生面积标准化后，aVNS+LPS组的Far Red阳性细胞与DAPI衍生面积的比例显著高于假手术+LPS组。

在讨论部分，研究表明aVNS减少了LPS诱导的BALF中TNF-α的增加，在刺激后24小时降低了脾脏重量，并与肺组织中CellTrace阳性信号数量的变化相关。aVNS降低BALF中TNF-α水平的发现支持了aVNS-交感神经通路激活诱导持续抗炎状态的概念。脾脏被认为是神经免疫通信的关键器官，脾脏重量的减轻可能是交感神经介导的脾脏收缩所致，这可能改变了脾脏血容量并影响脾脏细胞动力学。由于脾脏主要由交感神经支配，脾脏重量的减轻可能是通过交感神经系统激活介导的，而非直接迷走神经信号，这可能反映了脾脏内儿茶酚胺反应性免疫细胞的动员。研究人员此前证明了过继转移经β2-肾上腺素能受体激动剂沙丁胺醇预处理的脾脏CD4阳性T细胞可减轻受体小鼠的急性肺部炎症，这表明儿茶酚胺信号改变了脾脏免疫细胞的功能特性，使其能够在远端器官发挥抗炎作用。虽然肺中检测到的CellTrace阳性细胞的起源、表型和功能尚不清楚，但目前的观察结果表明，脾脏和免疫细胞动力学的改变可能伴随着aVNS的抗炎作用。研究也存在一定局限性，如未确定肺切片中CellTrace阳性对象的身份，无法确定其起源；未直接检验CellTrace信号变化与TNF-α降低的因果关系；且未评估脾脏组织学，无法解释脾脏重量减轻是否为结构重塑或细胞动员；此外，缺乏假手术+盐水对照组，无法确定独立效应。DAPI衍生面积的差异主要作为归一化指标，未来仍需进一步组织病理学研究。

研究结论部分翻译如下：总之，迷走神经传入刺激与降低的BALF TNF-α对LPS的反应、降低的脾脏重量以及肺组织中改变的CellTrace阳性信号相关。这些发现表明，脾脏和免疫细胞动力学的变化可能伴随迷走神经传入刺激的抗炎作用；然而，它们之间的因果关系和功能联系仍有待确定。