Sox2 调控区域 42 产生增强子 RNA，影响皮层发育过程中的神经元迁移

《iScience》：The Sox2 regulatory region 42 produces enhancer RNAs that influence neuronal migration during cortical development

　　

亮点•SRR42 是大脑皮层发育过程中的一个活跃调控区域•SRR42 活性在皮层发生过程中的神经祖细胞中富集•SRR42 缺失会破坏小鼠的神经元迁移和皮层分层•SRR42 来源的 eRNAs 调控皮层发生过程中的神经元定位摘要对神经祖细胞状态和神经元定位的精确调控对于皮层发育至关重要。在这里，我们鉴定了 Sox2 调控区域 42 (SRR42)，这是一个位于 Sox2 转录起始位点下游 42 kb 处的调控区域，表现出开放染色质、活跃组蛋白修饰以及增强子 RNA (eRNAs) 的双向转录。利用转基因报告小鼠，我们发现 SRR42 在发育中的皮层神经祖细胞中具有活性。结合单细胞多组学分析的 CRISPR-Cas9 介导的 SRR42 缺失揭示了祖细胞状态动态、神经元迁移和皮层分层的变化，且未检测到 Sox2 表达的变化。此外，体内敲低 SRR42 来源的 eRNAs 损害了神经元迁移。这些发现确定 SRR42 来源的 RNA 是皮层发育过程中神经元迁移的调控因子，并强调了增强子相关转录作为神经发育基因调控的功能组成部分。图文摘要引言增强子是关键的顺式调控元件，协调时空基因表达，并在后生动物物种的发育过程中起着至关重要的作用。, 全基因组分析表明，这些元件丰富，通常具有细胞类型特异性，并塑造了细胞身份核心的独特转录程序。,, 最近的研究表明，增强子转录是一个普遍现象，这导致增强子 RNA (eRNAs) 的产生，包括那些源自被称为超级增强子 (SEs) 的强效复合增强子簇的 eRNAs，它们在发育过程以及癌症等疾病中经常决定细胞身份。,, 尽管 eRNAs 最初被认为主要在顺式方向功能以调控附近基因的表达，但其对发育过程的更广泛功能影响仍然知之甚少，这突显了我们对增强子生物学理解中的一个关键差距。哺乳动物大脑皮层作为解析复杂发育过程底层基因调控机制的绝佳模型。皮层中神经元的正确生成和定位依赖于神经祖细胞 (NPCs) 内部紧密调控的转换。,, 神经祖细胞的一个特化子集，称为室管膜区 (VZ) 的放射状胶质细胞 (RG)，在早期神经发育期间进行自我更新，随后在脑室下区 (SVZ) 产生中间祖细胞 (IPCs)，IPCs 在皮层的上层产生神经元。,, 这些命运转换受动态基因表达程序调控，其中许多由增强子活性编排。,, 此类程序的失调可能导致神经发生受损、分层破坏和皮层畸形，这在几种神经发育障碍中可见。在神经发育的关键转录因子中，Sox2 在调节各种类型的干细胞和组织祖细胞,,,,, 包括 NPCs 方面发挥着至关重要的作用。Sox2 表达受 20 多个独特增强子控制，这些增强子位于 1.5 Mb 基因沙漠中，其中一些作为远端超级增强子塑造 Sox2 的表达。,, 以前的研究根据基因组距离定义了多个 Sox2 调控区域 (SRRs)。例如，SRR18 位于上游 18 kb，而 SRR107 和 SRR111 分别位于转录起始位点 (TSS) 下游 107 和 111 kb 处。重要的是，SRR107 和 SRR111 已被证明对胚胎干细胞 (ES) 中的 Sox2 调控至关重要。这种基于距离的命名法已被广泛采用，以确保 Sox2 调控研究中的清晰性和一致性。,, 此外，Sox2 基因座包含一个长非编码 RNA 基因，称为 Sox2 重叠转录本 (Sox2ot)，它与 Sox2 共表达，并与人类肺部和乳腺癌的形成以及 Sox2 表达的调控有关。因此，阐明 Sox2 的转录调控机制对于理解发育过程和肿瘤发生至关重要。然而，个别远端调控元件及其相关非编码转录本对神经元迁移等神经发育事件的贡献在很大程度上仍未被探索，特别是关于它们在发育过程中产生功能 eRNAs 的能力。在本研究中，我们鉴定了一个位于 Sox2 下游的保守远端增强子元件。根据既定的 SRR 命名法，并且因为该元件位于 Sox2 TSS 下游约 42 kb 处，我们将其称为 Sox2 调控区域 42 (SRR42)。该增强子表现出活跃的标志，包括开放染色质结构、组蛋白修饰以及表明 eRNA 产生的双向转录，特别是在 RG 群体中。为了调查该元件及其转录 eRNAs 的功能，我们使用了多管齐下的方法，结合转基因报告检测、CRISPR-Cas9 介导的 SRR42 基因座缺失以及基于 Cas13 的 SRR42 来源 eRNAs 敲低。我们的发现表明，SRR42 活性是皮层发育过程中神经祖细胞来源细胞正确迁移所必需的，且独立于 Sox2 表达变化。这些结果表明，增强子来源的 RNA 可能作为体内神经祖细胞行为的关键调控因子，扩展了非编码转录在发育基因调控网络中的功能库。结果鉴定参与 Sox2 基因调控的远端增强子区域Sox2 基因座周围环绕着多个远端调控元件；然而，这些增强子在神经发育过程中的具体作用仍然理解不完全。,,,, 为了鉴定活跃的增强子候选者，我们分析了来自胚胎小鼠前脑的公共转座酶可及性染色质测定测序 (ATAC-seq) 数据库。,,,, 如图 1A 所示，胚胎第 11.5 天 (E11.5)、12.5 (E12.5) 和 14.5 (E14.5) 的 ATAC-seq 图谱揭示了 Sox2 附近的几个开放染色质区域。在这些区域中，我们鉴定了一个特别引人注意的区域，位于 Sox2 下游 42 kb，在发育阶段中表现出一致的开放性。这个区域称为 SRR42，也显示了跨物种的保守性以及 H3K4me1 和 H3K27ac 等增强子标记的富集，特别是与转录活性相关的 H3K4me3，(图 1A)。为了将 SRR42 与以前表征的 SRRs 进行比较，我们检查了 SRR18、SRR85、SRR95、SRR107 和 SRR111 处的染色质可及性和组蛋白修饰图谱 (图 S1)。该分析显示，SRRs 根据发育阶段和细胞背景表现出不同的活跃相关染色质特征。SRR42 在 E14.5 前脑比在 mES 细胞中表现出更强的增强子相关染色质特征，表明 SRR42 在一个不同于几个以前表征的 SRRs 的发育背景下活跃。图 1 鉴定 E14.5 小鼠发育皮层中的活跃增强子显示完整标题图查看器 (A) E14.5 前脑区域 ATAC-seq 信号的全基因组浏览器视图，以及 E14.5 代表组蛋白修饰的染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq) 图谱，重点关注 Sox2 基因座。黑色矩形框出的区域对应于 Sox2 调控区域 42 (SRR42)，并放大以显示跨物种的进化保守性。SRR42 由红线指示，用于生成敲除小鼠的 CRISPR 靶位点由灰色倒三角形显示。紫色线代表转基因小鼠的报告序列。ATAC-seq 和 ChIP-seq 数据集是从 DNA 元素百科全书 (ENCODE) 项目 (https://www.encodeproject.org/) 获得的。(B) E14.5 小鼠前脑 SRR42 区域的染色质可及性，显示 ENCODE ATAC-seq 数据和 CAGE-seq 揭示的双向转录。(C) 热图显示来自 E14.5 组织的 SRR42 增强子 RNA (eRNA) 和邻近基因的相对表达水平。表达水平已标准化为 Gapdh，并相对于前脑样本计算，设为 1。热图颜色代表 log2 转换的相对表达值。SRR42 区域放大示意图说明了用于定量 SRR42 eRNA 表达的 RT-qPCR 引物的位置和方向。所用引物的序列列在表 S1 中。最近的研究表明，eRNAs 从增强子区域合成，并以顺式和反式调控方式功能。,, 此外，eRNA 转录从增强子区域双向发生，可以使用基因表达帽分析 (CAGE)-seq 检测。,, 因此，为了评估 SRR42 基因座的转录活性，我们使用来自 E14.5 小鼠皮层的 RNA 进行了 CAGE-seq。CAGE-seq 揭示了 SRR42 位点的双向转录，这是 eRNAs 的特征特征 (图 1B)。SRR42 来源转录本的表达进一步在胚胎组织中进行检查。我们还分析了 Sox2 及其邻近基因包括 miR-1897 和 Sox2ot 的表达 (图 1C)。如图 1C 所示，SRR42 eRNAs 优先在神经组织中表达，反映了包括 Sox2、Sox2ot 和 miR-1897 在内的邻近基因的表达模式。我们接着调查了 SRR42 区域是否在人类神经谱系中同样活跃。来自人类大脑发育 CATlas 的单细胞 ATAC-seq 数据显示在几个人类 RG 群体，包括 Rgl_Tel_1、Rgl_Tel_2 和 Rgl_Tel_dorsal 中，SRR42 等效基因座处存在开放染色质 (图 S2A)。人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 来源神经球体的 CAGE-seq 也显示在 SRR42 等效基因座处的双向转录 (图 S2B)，表明该调控区域在小鼠和人类神经祖细胞中均保守且具有转录活性。发育中大脑皮层中的 SRR42 增强子活性在 E14.5 小鼠的大脑皮层中，观察到了代表来自 SRR42 的 eRNAs 的转录；然而，SRR42 是否具有增强子活性仍然不清楚。为了验证 SRR42 的增强子活性，我们生成了 SRR42 报告小鼠，并空间调查了 SRR42 是否作为增强子功能。具体而言，我们通过连接最小小鼠热休克启动子和 lacZ 报告基因到包含 SRR42 序列的 2 kb 基因组片段 (chr3:34,691,323–34,693,322) 生成了转基因小鼠 (SRR42-2 kb; 图 2A)。在八个创始系中，三个 (#1, #2 和 #3) 显示出表明报告基因激活的 X-gal 染色 (图 S3)。显示出最强且最一致染色的 #1 系被选中进行进一步分析。图 2 胚胎大脑皮层中 SRR42 增强子活性的报告分析显示完整标题图查看器 (A) 使用 SRR42-2 kb 报告构建体生成转基因小鼠品系的示意图。2 kb 增强子片段 (chr3:34,691,323–34,693,322) 驱动 lacZ 表达。(B) SRR42-2 kb 报告小鼠 E10.5、E11.5 和 E12.5 胚胎以及 E14.5 大脑中的报告基因活性。在所示发育阶段对 #1 系进行 X-gal 染色。比例尺，1 mm。(C) E14.5 皮层的代表性 X-gal 染色。左侧方框区域在右侧图像中以更高放大倍数显示。比例尺，100 μm。(D) E14.5 皮层中针对 β-Gal (红色)、Sox2 (绿色) 和 Hoechst (蓝色) 的免疫组化代表性图像。箭头指示共表达 Sox2 和 β-Gal 的细胞。比例尺，50 μm。抗体来源和稀释度，以及 Hoechst 染色细节，提供在表 S2 中。为了评估 SRR42-2 kb lacZ 报告基因的发育表达模式，收集 #1 系胚胎于 E10.5、E11.5、E12.5 和 E14.5 并进行整体 X-gal 染色。如图 2B 所示，在 E10.5，lacZ 表达首先在嗅觉板、神经管和背根神经节中检测到。在其他 E10.5 胚胎中观察到类似的 X-gal 染色结果，证实了我们发现的可重复性 (图 S4)。这种表达随时间继续增加，到 E14.5，报告基因活性在背侧前脑中显著观察到 (图 2B)。对 E14.5 皮层的切片分析显示 VZ 中有强 X-gal 染色，表明神经祖细胞区域有局部增强子活性 (图 2C)。X-gal 染色结果表明 SRR42 在神经组织中功能，包括但不限于 Sox2 表达区域，如嗅觉板、神经管和皮层。使用抗 β-半乳糖苷酶抗体的免疫组化分析证实，β-半乳糖苷酶表达与 VZ 中 Sox2 阳性神经干细胞 (NSCs) 重叠 (图 2D)。此外，观察到一组缺乏 Sox2 表达的 β-Gal 阳性细胞。为了进一步表征 SRR42 报告基因活性的细胞背景，我们与 Neurogenin2 和 Tbr2 进行了共染色，分别与神经元承诺和中间祖细胞状态相关 (图 S5)。顶端区域的 LacZ 阳性细胞与 Neurogenin2 或 Tbr2 的重叠有限，而在更基底位置的 LacZ 阳性细胞中观察到部分重叠。这些发现表明 SRR42 在胚胎皮层中作为一个活跃增强子发挥作用，特别是在 VZ 内表达 Sox2 的 NSCs 中。其活性的时空特异性表明 SRR42 有助于皮层发育过程中神经祖细胞身份的转录调控。SRR42 敲除小鼠的生成和表型分析为了阐明 SRR42 的体内功能，我们通过电穿孔使用 CRISPR-Cas9 系统生成了敲除 (KO) 小鼠。CRISPR-Cas9 组件，包括靶向 SRR42 基因座上游和下游的序列的 guide RNA (gRNA) 和 Cas9 蛋白，被制备并引入原核期胚胎 (图 S6A 和 S6B)。

卵母细胞培养至二细胞期后，被移植到假孕母鼠体内。通过 PCR 和测序进行基因分型，证实五只建系动物中有四只发生了 SRR42 区域的缺失（图 S6B 和 S6C）。携带完全 SRR42 缺失的两个独立品系（#3 和#5）被用于后续分析。在胚胎发育第 14.5 天（E14.5），KO 胚胎外观大体正常，但与野生型（WT）和杂合子同窝幼崽相比，其体长表现出轻微但具有统计学意义的缩短（图 3A 和 S6D）。在出生后第 8 天（P8），KO 小鼠的嗅球（OB）长度与端脑长度的比率显著低于 WT 和杂合子小鼠（图 3B），表明脑发育可能存在改变。为了进一步表征 OB 表型，我们检查了 P0 时期 OB 的凋亡和祖细胞增殖情况。对 Cleaved-Caspase3 阳性细胞和磷酸化组蛋白 3（PH3）/Tbr2 双阳性祖细胞的定量分析显示，WT 和 SRR42-KO 小鼠之间无显著差异（图 S7A 和 S7B）。此外，在 P0 时期的 OB 中检测到了 SRR42 报告基因活性（图 S7C 和 S7D）。这些发现表明，SRR42 缺失影响早期脑结构，但在出生时不会引起大体形态异常或凋亡及祖细胞增殖的重大变化。相比之下，E17.5 胚胎的骨骼染色显示 WT 和 KO 动物之间无明显差异（图 3C），成年 KO 小鼠存活，且表现出正常的外部形态和生长模式（图 3D）。

图 3 通过电穿孔 CRISPR-Cas9 复合物生成 SRR42 敲除（KO）小鼠
(A) E14.5 野生型（WT）和 SRR42-KO 胚胎的代表性图像。比例尺，2 mm。右侧的图表显示了 WT 和 KO 胚胎之间体长的定量比较。每个数据点显示为空心圆圈。黑线代表中位数，灰线表示平均值。?p < 0.05，Tukey-Kramer 检验（n = 10 WT，24 +/?，8 KO 小鼠）。
(B) WT 和 KO 小鼠出生后第 8 天（P8）大脑的代表性图像。比例尺，2 mm。右侧的图表显示了嗅球长度与大脑长度的比率。每个数据点显示为空心圆圈。黑线代表中位数，灰线表示平均值。?p < 0.05，Tukey-Kramer 检验（n = 9 WT，23 +/?，11 KO 小鼠）。
(C) 用茜素红（骨骼，红色）和阿尔新蓝（软骨，蓝色）染色的 E17.5 WT 和 KO 胚胎的矢状面视图。比例尺，2 mm。
(D) 成年 WT 和 KO 小鼠的大体外观。KO 小鼠存活，且表现出与 WT 同窝幼崽相当的正常生长。

这些发现表明，SRR42 缺失影响早期脑结构，但未引起大体形态异常。

单细胞多组学分析揭示了 SRR42 敲除皮层中的染色质和转录改变

为了探索 SRR42 缺失的细胞和分子后果，我们对 WT 和 KO 胚胎的 E14.5 皮层组织进行了单核 RNA 测序（snRNA-seq）和单核 snATAC-seq 的联合分析（图 4A）。这种整合的单细胞多组学方法能够同时绘制数千个独立细胞核的染色质可及性和基因表达图谱。这种方法能够在同一个体细胞内直接比较转录状态和染色质可及性，从而鉴定与 SRR42 缺失相关的细胞类型特异性调控特征。在质量过滤后，总共保留了来自 WT 的 6,222 个细胞核和来自 KO 皮层的 5,242 个细胞核（图 S8A）。质量指标包括 RNA 计数、TSS 富集、核小体信号和线粒体读取含量，在基因型之间具有可比性（图 S8B）。

图 4 SRR42-KO 和 WT 皮层中 snRNA-seq 和 snATAC-seq 的单细胞多组学分析
(A) 对 WT 和 KO 小鼠胚胎皮层组织进行单核 RNA-seq（snRNA-seq）和 ATAC-seq（snATAC-seq）的原理概述。
(B) SRR42 位点（chr3:34,682,107–34,702,549; mm10）周围的染色质可及性图谱，显示为来自合并 snATAC-seq 数据的伪 bulk 轨道。红色和绿色信号分别代表 WT 和 KO 样本。SRR42 区域由红线指示，并在右侧以更高放大倍数显示。
(C) 一组 UMAP 投影，显示不同皮层细胞群体标记基因的缩放表达：Sox2（NSC_M 和 NSC）、Pax6（NSC_M 和 NSC）、Mki67（有丝分裂细胞）、Eomes（SVZ）、Bcl11b（V–VI 层）、SatB2（II–IV 层）、Gad2（中间神经元）和 Reln（I 层）。高表达区域用蓝色表示，低表达区域用灰色表示。
(D) 集成加权最近邻（WNN）分析的 UMAP 投影，按注释的皮层细胞类型着色。
(E) 基于 NSC_M 和 NSC 子集的伪 bulk snATAC-seq 数据，SRR42 位点（chr3:34,687,107–34,697,549; mm10）周围的染色质可及性图谱。
(F) 小提琴图显示 Sox2、Sox2ot、Neurog2、Hes1、Hes5 和 Mki67 在 NSC_M 和 NSC 群体中的表达。
(G) 小提琴图显示 NSC_M（WT：n = 942，KO：n = 882 个细胞）和 NSC（WT：n = 818，KO：n = 694 个细胞）群体中 Sox2 和 Sox2ot 的表达。????p < 0.0001；ns，无显著差异；Welch t 检验。

对 snATAC-seq 数据的伪 bulk 分析显示，KO 样本中 SRR42 位点的染色质可及性丧失，证实了基因组缺失（图 4B）。接下来，通过对 snRNA-seq 和 snATAC-seq 数据进行降维创建均匀流形近似和投影（UMAP），随后进行加权最近邻（WNN）分析，代表 RNA 和 ATAC-seq 模式的加权组合（图 S8C）。该分析显示，我们的数据集包含 17 个在转录和表观遗传上 distinct 的聚类（图 S8C、S9A 和 S9B）。基于已知标记基因，参照皮层细胞类型注释框架，将这些聚类进一步分为九种主要细胞类型，包括 NSCs（NSC_M 和 NSC；Sox2、Pax6）、有丝分裂细胞（NSC_M；Mki67）、中间祖细胞（SVZ；Eomes）、投射神经元（V–VI 层和 II–IV 层；分别为 Bcl11b 和 SatB2）、中间神经元（Gad2）、I 层神经元（Reln）、小胶质细胞（Trem2）、内皮细胞（Igfbp7）和脉络丛细胞（Otx2）（图 4C、4D、S9B 和 S9C）。值得注意的是，我们将 NSCs 聚类细分为两组：NSC 和 NSC_M。NSC_M 群体对应于有丝分裂活跃的 NSCs，其特征是高 Mki67 表达，这与之前的报道一致。为了验证基于 RNA 的细胞类型注释与染色质可及性图谱之间的一致性，我们在单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）和 scATAC-seq 模式之间进行了多模态标签转移分析（图 S10）。该分析显示，基于转录组的细胞身份分配与基于 ATAC 的细胞身份分配一致，支持了基于整合单细胞多组学的细胞类型注释的可靠性。为了进一步表征祖细胞异质性，我们基于伪时间重构使用 Monocle3 进行了轨迹分析（图 S11A）。该分析将 NSC_M 细胞置于最早的伪时间状态，表明与更广泛的 NSC 群体相比，该群体代表了一种相对未分化的祖细胞状态。

为了确定哪些细胞类型在 SRR42 位点具有活跃染色质，我们分析了已识别细胞类型跨度的伪 bulk snATAC-seq 图谱。SRR42 位点的染色质可及性在神经干/祖细胞群体中最高，特别是 NSC_M 和 NSC，在 SVZ 祖细胞和上层投射神经元中检测到额外的显著较弱信号（图 S9D）。这种模式与之前的报告基因活性密切平行，表明 SRR42 具有细胞类型特异性的增强子功能。为了进一步解析密切相关群体之间的增强子使用情况，我们比较了 NSC_M 和 NSC 群体之间 SRR42 区域的染色质可及性。值得注意的是，NSC_M 群体在 SRR42 位点表现出明显且稳健的峰值，而 NSC 群体仅显示出微弱的可及性（图 4E）。这些发现表明，SRR42 增强子活性在 NSC_M 群体中尤为突出。

接下来，我们评估了 NSC_M 和 NSC 群体内的基因表达图谱。Sox2 表达主要富集在 NSC_M 群体中，而 NSC_M 和 NSC 群体均表达 Sox2ot 和 Mki67，这与增殖活性一致（图 4F）。Neurog2 在 NSCs 中表达，表明这些祖细胞库存在神经元承诺。为了调查 SRR42 缺失对局部转录程序的影响，我们分析了 SRR42 位点邻近基因的表达。在 KO 样本中，与 NSCs 相比，NSC_M 细胞中的 Sox2 表达显著增加，而 Sox2ot 表达基本不受影响（图 4G）。为了确定观察到的 Sox2 mRNA 上调是否导致蛋白质水平相应增加，我们对 WT 和 SRR42-KO 小鼠的 E14.5 皮层切片进行了定量免疫组织化学分析（图 S12）。我们发现，与 WT 相比，SRR42-KO 皮层中 Sox2 阳性细胞的整体比例显著增加（图 S12A 和 S12B，左）。然而，平均荧光强度——即单个细胞蛋白质水平的测量值——在 WT 和 KO 之间显示无显著差异（图 S12A 和 S12B，右）。此外，通过 Western blot 分析，我们检测到 E14.5 WT 和 KO 皮层之间 Sox2 蛋白丰度无显著差异（图 S12C）。这些结果表明，虽然在不存在 SRR42 的情况下表达 Sox2 的细胞库扩大了，但单个细胞内 Sox2 蛋白的浓度保持在稳定水平，这可能是通过稳健的转录后或翻译后调控机制实现的。为了检查 SRR42 缺失是否改变其他 SRRs 的可及性，我们分析了之前表征的 SRR 位点跨度的 scATAC-seq 图谱（图 S13A 和 S13B）。观察到在 SRR42-KO NSC_M 细胞中 SRR18 的染色质可及性增加，而在其他几个已知的 SRR 区域未检测到重大变化。由于 SRR18 是已知的神经干/祖细胞增强子，这些发现表明 SRR42 缺失可能改变 Sox2 调控景观内增强子活性的平衡。

标准放射状胶质细胞（RG）标记物（如 Fabp7、Slc1a3 和 Vim）的表达表现出基因型依赖性变化，表明该效应可能受细胞类型影响（图 S9E）。差异表达基因（DEGs）的数量在不同细胞类型间有所变化，在 NSC_M、NSC 和 SVZ 群体中观察到最显著的变化（图 S9F）。Gfap 和 Hes1 在 NSC_M 或 NSC 群体中均未检测到表达。相比之下，在 KO 皮层中，NSC_M 和 NSC 群体的 Hes5 表达均增加（图 S9E），表明 Notch 信号调控可能存在变化。总之，这些数据表明 SRR42 在 NSC_M 群体中选择性活跃，其缺失导致 NSC 谱系中出现靶向转录变化，而不破坏一般干细胞身份。SRR42 染色质可及性在 NSC_M 群体中的选择性富集，以及其对 SRR42 缺失加强的转录反应性，表明承诺程度较低的 NSCs 在早期皮层发育期间对增强子扰动更敏感。

SRR42 缺失损害神经祖细胞迁移和皮层结构

为了评估 SRR42 缺失对皮层发育的体内效应，我们分析了胚胎小鼠大脑中的细胞组成、基因表达和祖细胞动态。基于单细胞多模态数据的细胞类型组成分析显示，KO 皮层中有丝分裂活跃的 NSC_M 和 SVZ 群体略有增加，而与 WT 相比，II–IV 层和 V–VI 层中间神经元和投射神经元群体的比例略有减少（图 5A）。我们还检查了沿分化轨迹的基因型依赖性差异（图 S11B）。KO 细胞在早期伪时间状态相对富集，而 WT 细胞在较晚的分化状态更丰富。这些发现表明 SRR42-KO 祖细胞沿分化轨迹的进程发生改变。因为细胞类型组成分析显示变化不仅发生在 NSC_M 中，还发生在 SVZ 和皮层层群体中，我们检查了 WT 和 KO 小鼠之间皮层细胞的基因表达差异（图 S9F）并进行了基因本体论（GO）分析（图 5B）。在 NSC_M 群体中，DEGs 富集在与细胞迁移相关的术语中。在 SVZ 群体中，与“神经元投射形态发生”相关的基因差异表达，而在 II–IV 层和 V–VI 层，DEGs 与中枢神经系统发育相关（图 5B）。鉴于观察到的与神经发育相关基因的变化，我们通过免疫组织化学检测 PH3（一种有丝分裂标记物），调查了 E14.5 皮层切片中神经祖细胞的细胞分裂（图 5C）。

虽然野生型（WT）和敲除型（KO）胚胎沿脑室表面（VS）的 PH3+ 细胞数量相当，但与 WT 小鼠相比，KO 皮层在 VS 以外的区域（图 5C 中称为非表面 [NS]）显示出 PH3+ 细胞数量显著增加，这表明分裂细胞的位置异常（图 5C）。

图 5 SRR42 调节发育中大脑皮层神经祖细胞的迁移
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(A) 显示 WT 和 KO 皮层中每种皮层细胞类型比例的水平堆叠 100% 条形图。(B) 点图表示 WT 和 KO 样本之间跨皮层细胞类型的差异表达基因（DEGs）的基因本体（GO）富集分析。与生物过程相关的 GO 术语按显著性（-log10 校正 p 值）排序。使用 g:Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 进行分析。(C) WT 和 KO 小鼠 E14.5 皮层中磷酸化组蛋白 H3 (PH3) 的免疫组织化学染色，PH3 标记为红色，细胞核用 Hoechst 蓝色复染。比例尺，50 μm。白色箭头指示 NS 定位的 PH3+ 细胞。右侧显示了位于沿脑室表面 (VS) 或表面外 (非表面；NS) 的 PH3+ 细胞的定量。数值代表每 100 μm 脑室长度的 PH3+ 细胞数量。每个数据点显示为一个空心圆。黑线代表中位数，白线表示平均值。?p < 0.05，双尾非配对 Student t 检验（每个基因型 n = 9 个切片来自 N = 3 只小鼠）。(D) WT 和 KO 小鼠 E14.5 皮层中 Tbr2 (Eomes) 的免疫组织化学染色，Tbr2 显示为红色，细胞核用 Hoechst (蓝色) 复染。比例尺，50 μm。左图：脑室区 (VZ) 内 Tbr2+ 细胞占总数的百分比。每个数据点显示为一个空心圆。黑线代表中位数，白线表示平均值。右图：VZ 内 Tbr2+ 细胞的分布，细分为三个相等的区间 (BIN1–BIN3)。数据以平均值 ± 标准差 (SD) 表示。?p < 0.05；??p < 0.01，双尾非配对 Student t 检验（每个基因型 n = 9 个切片来自 N = 3 只小鼠）。(E) 在 E14.5 时给予 BrdU，并通过免疫组织化学分析 P8 皮层切片中的 BrdU 掺入。免疫组织化学染色显示 BrdU 为绿色，SatB2 为红色，细胞核用 Hoechst 蓝色复染。比例尺，200 μm。图表显示 WT 和 KO 小鼠中 BrdU+ 细胞从 II 层到 VI 层沿皮层深度跨 10 个等间距区间的分布。数据以平均值 ± SD 表示。?p < 0.05；??p < 0.01，双尾非配对 Student t 检验（每个基因型 n = 9 个切片来自 N = 3 只小鼠）。所用抗体的来源和稀释度列于表 S2。

在此分析之后，我们专注于特定祖细胞群的定位和分布。特别是，我们检查了 Tbr2 (Eomes) 阳性细胞的分布，因为它们在皮层中的位置可以提供关于 WT 和 KO 小鼠之间观察到的增殖差异的进一步见解。在 E14.5 时，我们观察到 KO 小鼠 VZ 中 Tbr2+ 细胞的总体比例略高于 WT 小鼠 (图 5D)。为了获得更详细的见解，我们将 VZ 细分为三个区室，并分析了每个区室内 Tbr2+ 细胞的分布。VZ 内的空间分析显示，在 KO 小鼠中，BIN1（邻近 VS 的区室）中 Tbr2+ 细胞显著积聚。相比之下，位于 SVZ 附近的 BIN3 中的 Tbr2+ 细胞在 WT 小鼠中更为丰富 (图 5D)。这些发现表明，在缺乏 SRR42 的情况下，祖细胞的位置发生了改变。

为了评估这些祖细胞定位的早期缺陷是否影响长期的皮层组织，我们在 E14.5 时给怀孕小鼠施用 BrdU，随后在 P8 时分析小鼠的皮层 (图 5E)。与 WT 相比，KO 皮层表现出 BrdU+ 细胞在皮层各层分布的改变，向更深位置偏移，表明迁移延迟或受阻 (图 5E)。在神经元迁移异常的小鼠皮层中发现了异位组织。检查 P8 小鼠皮层时，发现 KO 小鼠皮层有明显的发育不良，包括神经元分层紊乱 (图 S15A) 和皮层板中异常的 Nestin 阳性细胞聚集体 (图 S15B)。在 E18.5 时，Satb2 和 Ctip2 的免疫染色显示存在投射神经元的异位簇，进一步证实了迁移异常 (图 S15C)。综上所述，这些结果表明 SRR42 缺失破坏了胚胎发育期间的祖细胞定位和迁移，最终导致皮层畸形。

SRR42 衍生 eRNAs 调节胚胎皮层中的神经元迁移
为了直接评估 SRR42 衍生 eRNAs 在神经元发育中的功能作用，我们使用了一种针对 RNA 的 CRISPR 系统，并带有 RfxCas13d，以敲低 SRR42 eRNA 转录本。因此，RfxCas13d 和 SRR42 特异性 gRNAs 作为敲低 (KD) 载体，而针对 lacZ 的 gRNAs 作为阴性对照 (CTRL)。为了证实 Cas13d 介导的敲低 (KD) 的有效性，我们定量分析了体外初级皮层细胞中 SRR42 eRNA 和邻近转录本（包括 Sox2 和 miR-1897）的表达水平。逆转录 - 定量 PCR (RT-qPCR) 分析显示，KD 后 SRR42 eRNA 水平显著降低 (p < 0.05，图 S14)。相比之下，Sox2 (p = 0.6857) 和 miR-1897 (p = 0.2026) 的表达水平没有显著改变。这些发现表明，在这些实验条件下，Cas13d 介导的 KD 降低了 SRR42 衍生的转录本，而未对邻近 RNAs 产生可检测的影响 (图 S14)。

接下来，我们通过体内电穿孔将 KD 载体引入 E14.5 小鼠的皮层。共电穿孔 pCAGGS-RFP 质粒以标记转染细胞，并在 48 小时后的 E16.5 时收集大脑进行分析 (图 6A)。

图 6 SRR42 eRNAs 参与调节神经元细胞迁移
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(A) 体内电穿孔程序的示意图。组织样本在电穿孔后 48 小时收集。(B) 敲低 (KD) SRR42 eRNAs 后 E16.5 皮层中神经元迁移的免疫组织化学分析。pCAGGS-RFP 作为荧光标记共电穿孔，RFP 显示为红色，细胞核用 Hoechst (蓝色) 复染。比例尺，100 μm。通过计算位于脑室区 (VZ) 的 RFP 阳性细胞相对于 RFP 阳性细胞总数的比例来定量细胞迁移。每个数据点显示为一个空心圆。黑线代表中位数，白线表示平均值。???p < 0.001，双尾非配对 Student t 检验（每组 n = 9 个切片来自 N = 3 只小鼠）。所用质粒的来源，以及抗体的来源和稀释度，连同 Hoechst 染色细节，列于表 S2。(C) 对照 (CTRL) 与敲低 (KD) 皮层发育的示意图。KD 导致 IPCs 和神经元迁移延迟，与对照相比，VZ 中保留的 IPCs 密度更高。缩写：VZ，脑室区；SVZ，脑室下区；IZ，中间区；CP，皮层板；BM，基底膜；VS，脑室表面。

免疫组织化学分析显示，在 CTRL 条件下，RFP+ 细胞已大部分迁移出 VZ，占据了 SVZ 和中间区。相比之下，SRR42 eRNAs 的 KD 导致 RFP+ 细胞在 VZ 内显著积聚，表明径向迁移受损。定量分析证实，与对照组相比，KD 组中保留在 VZ 内的 RFP+ 细胞比例显著增加 (图 6B)。这些结果表明，SRR42 衍生的 eRNAs 有助于调节发育中皮层神经祖细胞的迁移 (图 6C)。

讨论
在本研究中，我们鉴定了 Sox2 位点下游的一个保守远端增强子元件 SRR42，并证明它在调节皮层发育期间神经元祖细胞迁移中起关键作用。我们的发现表明，SRR42 活性不仅表现为染色质可及性和组蛋白修饰等经典增强子特征，还表现为双向转录的 eRNAs 的产生 (图 1B)。使用 CRISPR-Cas9 介导的缺失和体内敲低方法 (图 6A 和 S6A)，我们提供了功能证据，表明 SRR42 衍生的 eRNAs 独立于 Sox2 转录激活影响祖细胞定位，突出了神经发育中以前未被重视的调控层。

以前的研究已经确立，增强子区域可以通过促进长距离染色质相互作用和调节转录因子招募来驱动基因表达。最近，eRNAs 作为有助于这些过程的潜在调控分子应运而生。然而，eRNAs 的体内功能，特别是在皮层发生等复杂发育过程的背景下，仍然知之甚少。我们的结果通过证明从 SRR42 转录的那些 eRNAs 在协调神经祖细胞径向迁移中起非冗余作用，扩展了 eRNAs 的功能库。

值得注意的是，此处鉴定为 SRR42 的基因组区域与以前表征的 D1 增强子重叠。在鸡中，据报道 D1 在早期发育期间驱动头外皮层和耳原基中的 Sox2 表达。最近，Iida 等人证明，位于 Sox2 下游 40–50 kb 的小鼠 D1 增强子通过 SOX2 和 ZIC2 的协同结合在神经管和神经嵴中被激活。有趣的是，删除小鼠 D1 增强子并未产生明显的发育缺陷，表明 Sox2 调控元件之间存在功能冗余。因此，虽然 D1 区域主要在 Sox2 转录激活和增强子冗余的背景下进行研究，但我们的发现表明，从 SRR42/D1 重叠区域产生的转录本可能额外有助于皮层发育期间的祖细胞行为。这些观察结果扩展了该位点除了经典增强子介导的转录激活之外的潜在功能意义。

我们的报告基因分析和单细胞多组学谱分析显示，SRR42 活性在早期皮层发生期间的 NSC_M 群体中富集，该群体在 SRR42 位点表现出最高的染色质可及性 (图 2 和 4E)。尽管转基因报告基因构建体包含 SRR42 序列本身，但我们没有观察到 SRR42-LacZ 胚胎中内源性 Sox2 表达模式或皮层形态的明显改变，这表明报告基因构建体在这些条件下没有大幅干扰 Sox2 调控。与更广泛的 NSC 群体相比，NSC_M 中 SRR42 的更强可及性可能反映了 Sox2 相关调控景观内细胞状态特异性的染色质组织。以前的研究表明，Sox2 位点在从 ES 细胞向神经干细胞/祖细胞过渡期间经历染色质结构的动态重塑，包括亚 TAD 组织和增强子 - 启动子相互作用的变化。此外，据报道 SOX2 在 NPCs 中结合 Sox2 相关染色质结构域内的调控区域。鉴于 NSC_M 细胞代表早期/增殖性祖细胞状态，SRR42 可及性可能通过细胞状态特异性的染色质配置或转录因子占据在该群体中增强。未来的染色质相互作用分析将需要直接测试这种可能性。

有趣的是，尽管 SRR42-KO 小鼠中 SRR42 位点成功缺失，但 Sox2 表达在 NSC_M 群体中上调 (图 4G)。SRR42 缺失与 NSC_M 细胞中 SRR18 染色质可及性增加相关。因为 SRR18 是已确立的神经干细胞/祖细胞增强子，这一观察结果提出了 SRR42 通过调节 Sox2 相关调控区域之间的调控相互作用间接贡献于 Sox2 相关调控的可能性，而不是仅作为直接的 Sox2 增强子本身发挥作用。对 Sox2 表达的相对轻微影响进一步表明，SRR42 并不全局调控整个 Sox2 相关染色质结构域，而是参与该位点内的选择性调控相互作用。这些发现表明，SRR42 可能以细胞类型特异性的方式调节不同的靶标，且其在祖细胞行为中的作用可能不限于经典基因激活。值得注意的是，通过 Cas13d 介导的 RNA 靶向体内敲低 SRR42 eRNAs 导致神经元迁移延迟 (图 6)，进一步支持了增强子转录本可以直接影响发育过程中细胞定位的观点。

此外，SRR42-KO 细胞的 GO 分析表明，它可能影响 NSC_M 群体的迁移，NSC_M 是 NSC 的一个增殖亚群，以高 Mki67 表达为标志 (图 5B)。此外，免疫组织化学分析显示，在 SRR42 缺陷皮层中，有丝分裂 (PH3+; 图 5C) 细胞（可能对应于 NSC_M 群体）和中间祖细胞 (Tbr2+; 图 5D) 细胞在 VS 外积聚，以及出生后大脑中 BrdU 标记细胞的迁移延迟 (图 5E)。这些表型被 eRNA 特异性敲低重现，支持了 SRR42 衍生的 eRNAs 在调节皮层分层期间祖细胞动态行为中的功能作用 (图 6B)。

我们的研究结果提出了关于 SRR42 来源 eRNA 调节神经元迁移机制的重要问题。尽管本研究并未直接区分顺式和反式作用功能，但可以考虑几种合理的模型。SRR42 处染色质可及性和活跃组蛋白标记的富集与涉及局部染色质相互作用的顺式调节作用一致。相反，SRR42 来源转录本的检测提出了这些 eRNA 通过与 RNA 结合蛋白的相互作用在反式发挥作用的可能性。尽管我们检查了代表性的神经元迁移和细胞骨架相关基因，但未观察到能清楚解释迁移表型的恒定转录特征。因此，SRR42 来源 eRNA 调节神经元迁移的机制仍未解决。一种可能性是这些 eRNA 通过局部染色质相互作用或 RNA-蛋白相互作用起作用，影响祖细胞行为而不引起经典细胞骨架基因稳态表达的大幅变化。未来的研究需要使用 RNA 互作组分析、染色质构象测定和活体成像来区分这些可能性。与主要在腹侧前脑中间神经元特化中起作用的 Dlx1/2 位点增强子相关转录本不同，SRR42 来源的 eRNA 似乎在大脑皮层祖细胞群中发挥作用。这种区别提出了 SRR42 可能不仅促进神经元命运决定本身，而是促进与神经元迁移相关的祖细胞行为的可能性。有趣的是，SRR42 缺乏导致类似异位症的异常，而不是如 Reeler 突变体中观察到的广泛层化逆转。因为层化逆转通常与位置信号通路中断有关，而异位症可能源于迁移进展或持续性的受损，这些发现表明 SRR42 相关调节可能优先影响与迁移相关的细胞程序。尽管确切机制仍未解决，但与细胞骨架组织或细胞粘附相关的通路可能促成这些表型。多模态分析使我们能够整合开放染色质状态和基因表达模式的信息（图 4 和 S9）以确定单个细胞的状态。然而，这些分析不包括关于细胞的空间信息。最近，空间转录组学使得能够基于特定基因表达在组织切片中对单个细胞进行空间表征。鉴于 SRR42-KO 小鼠表现出神经元迁移延迟，对 KO 脑切片进行空间转录组学分析可能有助于通过追踪单个细胞的特征来阐明神经元迁移的机制。

在 SRR42-KO 小鼠中，P8 时嗅球（OB）的比例减少（图 3B）。鉴于我们的报告基因小鼠分析所示的 SRR42 增强子的区域特异性活性（图 2B），观察到的 OB 表型可能反映了 SRR42 缺失的区域自主效应。该增强子在发育中的嗅板 和神经管中的活性表明，SRR42 可能对特异性于嗅区的祖细胞群行使直接调节控制。然而，需要进一步实验来最终确定该表型是在嗅球祖细胞中以细胞自主方式产生，还是受更广泛发育中断的次级影响。此外，尽管 SRR42-KO 小鼠中 OB 体积的减少相对较轻，但这种表型与扰动单个调节元件而不是核心发育调节因子的效应一致。OB 发育涉及的关键因子完全缺失可能导致严重畸形，而调节元件扰动可能产生更受限或阶段特异性的效应。在 SRR42-KO 小鼠中，P0 OB 中的细胞凋亡和祖细胞增殖未显著改变，而在 OB 内检测到了 SRR42 报告基因活性（图 S7C 和 S7D）。这些发现表明 P8 观察到的 OB 体积减少可能反映了出生后成熟或精修缺陷，而不是 OB 神经发生的主要早期缺陷。此外，转基因小鼠的数据表明，SRR42 区域不仅在胎儿中期神经发生期间活跃，还在成体大脑的特定部分活跃（图 S3）。尽管 SRR42-KO 小鼠在成年期存活，但它们可能表现出行为异常。对这些小鼠的行为分析可能进一步阐明 SRR42 的整体功能。

尽管有这些见解，SRR42 eRNA 发挥作用的精确分子机制仍不清楚。潜在机制包括调节特定位点的转录活性、染色质重塑以及与影响细胞骨架动力学或迁移相关信号通路的 RNA 结合蛋白相互作用。未来整合空间转录组学、RNA 互作组谱分析和活细胞成像的工作对于揭示增强子转录如何在分子水平上与祖细胞行为相关联至关重要。此外，由于转基因报告基因构建物包含 SRR42 序列的额外拷贝，不能完全排除对内源调节状态的影响，尽管在 SRR42-LacZ 胚胎中未观察到皮层形态或组织结构的明显大体异常。

总之，我们的研究确定 SRR42 是通过 eRNA 介导的机制在大脑皮层发育过程中神经元迁移的关键调节因子。这些发现推进了我们对大脑皮层发育表观遗传调节的理解，并可能对神经发育障碍产生影响。对增强子元件（如 SRR42）的进一步研究可能会提供关于控制大脑发育的复杂调节机制的额外见解。

本研究的局限性
本研究存在若干局限性。首先，我们的表型分析主要集中于胚胎期和出生后早期阶段，未探索 SRR42 缺乏对成年大脑功能和行为的长期影响；因此，需要对成年小鼠进行未来的行为和神经回路分析。其次，体内实验完全依赖小鼠模型，这可能无法完全重现人类皮层发生的复杂时空动态，需要使用人类来源系统（如脑类器官）进行未来研究。第三，SRR42 来源的 eRNA 调节祖细胞迁移的精确分子机制仍未解决。在未来研究中整合空间转录组学、RNA 互作组谱分析和活细胞成像对于阐明此机制至关重要。

资源可用性
主要联系人
更多信息及资源和试剂请求应发送至并由主要联系人 Jun Kohyama ([e-mail]) 履行。

材料可用性
本研究中生成的 SRR42 报告基因和 KO 小鼠品系将在合理请求下由主要联系人提供。

数据和代码可用性
•本研究中使用的高通量数据已存入基因表达综合数据库（GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。单细胞多组学数据集可通过登录号 GEO: GSE282390 获取，小鼠皮层 CAGE 数据集可通过登录号 GEO: GSE296925 获取，hiPSC 来源神经球 CAGE 数据集可通过登录号 GEO: GSE297056 获取。
•本文未报告原始代码。
•重新分析本文报告数据所需的任何额外信息均可应要求从主要联系人处获得。

致谢
我们感谢庆应义塾大学医学院生理学系的成员进行讨论。我们也感谢庆应义塾大学医学院协作研究资源提供技术支持。我们感谢岐阜大学的 Shingo Miyawaki 博士就敲除小鼠的生成提供技术建议。我们也感谢山形大学的 Osamu Nakajima 博士生成转基因动物。我们感谢 CiRA 提供 hiPSCs。我们感谢早稻田大学的 Masaki Kakeyama 博士及其实验室学生提供动物护理方面的技术协助。本研究受 JSPS KAKENHI（授予 J.K. 的资助号 19H03623 和 24K02571）和早稻田大学全球研究中心（GRC）支持计划（项目编号 GRC-kyoten-05）资助。我们感谢 Edanz 的 Michal Bell 博士对本手稿草稿进行编辑。

作者贡献
概念构思，S.B. 和 J.K.；方法论，S.B.、T.S.、R.T.、N.M. 和 A.T.；调查，S.B.、T.S. 和 J.K.；撰写初稿，S.B. 和 J.K.；审阅和编辑，H.O.；资金获取，J.K.

利益声明
Hideyuki Okano 是 San Bio, Co., Ltd. 和 K Pharma Inc. 的受酬科学顾问。

写作过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
在本工作准备期间，作者使用 ChatGPT 和 Paperpal 进行语法完善和排版错误纠正。作者根据需要审阅和编辑了输出内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

STAR★方法
关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| :--- | :--- | :--- |
| 抗体 | | |
| Anti-β-galactosidase | MBL | Cat# M203-3; RRID: AB_10697365 |
| Anti-Sox2 | R&D Systems | Cat# MAB2018; RRID: AB_2286684 |
| Anti-SatB2 | Abcam | Cat# ab92446; RRID: AB_10563678 |
| Anti-BrdU | Abcam | Cat# ab6326; RRID: AB_305426 |
| Anti-Ctip2 | Abcam | Cat# ab18465; RRID: AB_2064130 |
| Anti-NeuN | Millipore | Cat# MAB377; RRID: AB_2298772 |
| Anti-Phospho-Histone H3 (pH3) | Cell Signaling Technology | Cat# 9706; RRID: AB_331535 |
| Anti-Tbr2 | Millipore | Cat# AB15894; RRID: AB_10615604 |
| Anti-Ds-Red | Nittobo Medical | Cat# MSFR101410 |
| Anti-Nestin | Millipore | Cat# MAB353; RRID: AB_94911 |
| Anti-Cleaved Caspase-3 | Cell Signaling Technology | Cat# 9661; RRID: AB_2341188 |
| Anti-Neurogenin-2 | Millipore | Cat# MABN1814 |
| Anti-GAPDH | Cell Signaling Technology | Cat# 2118; RRID: AB_561053 |
| 化学物质、肽和重组蛋白 | | |
| DMEM/F12 medium | Fujifilm Wako | Cat# 042-3079 |
| B-27 Supplement (50×) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | Cat# 17504-044 |
| GlutaMAX (100×) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | Cat# 35050-061 |
| HBSS | Fujifilm Wako | Cat# 084-08345 |
| Phosphate Buffered Saline (10×) (pH 7.4) | Nacalai Tesque | Cat# 27575-31 |
| TrypLE Select | Gibco/Thermo Fisher Scientific | Cat# 12563-029 |
| Bovine Fibronectin | Sigma-Aldrich | Cat# F4759 |
| L-Ornithine homopolymer hydrobromide | Sigma-Aldrich | Cat# P3655 |
| Water sterile-filtered | Sigma-Aldrich | Cat# W3500 |
| Blocking One | Nacalai Tesque | Cat# 03953-66 |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | Cat# 09154-85 |
| iFluor? 555 Styramide | AAT Bioquest | Cat# 45027 |
| ezDNase? Enzyme | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11766051 |
| TRI Reagent | Sigma-Aldrich | Cat# T9424 |
| Hoechst 33258 | Invitrogen | Cat# H3569 |
| 关键商业测定 | | |
| Primary Mouse Neuron Nucleofector? Kit | Lonza | Cat# VPG-1001 |
| mirVana? miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | Cat# AM1560 |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | Cat# 74134 |
| ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix | TOYOBO | Cat# FSQ-201 |
| Fast SYBR? Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4385617 |
| Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle (4 rxns) | 10× Genomics | Cat# PN-1000285 |
| 存盘数据 | | |
| ATAC-seq_mouse (ENCODE) | The ENCODE Project Consortium et al. | https://www.encodeproject.org/ |
| ATAC-seq_human (CatLas) | Li et al. | https://catlas.org/catlas/ |
| ChIP-seq (ENCODE) | The ENCODE Project Consortium et al. | https://www.encodeproject.org/ |
| DNase-seq (ENCODE) | The ENCODE Project Consortium et al. | https://www.encodeproject.org/ |
| CAGE-seq_mouse E14.5 cortex | This study | GEO: GSE296925 |
| CAGE-seq_hNSCs | This study | GEO: GSE297056 |
| scATAC+scRNA-seq | This study | GEO: GSE282390 |
| 实验模型：细胞系 | | |
| hiPSC lines YZWJs513 | CiRA Foundation | N/A |
| Primary mouse cortical neurons | This paper (Isolated from E14.5 mice) | N/A |
| 实验模型：生物体/品系 | | |
| Mouse C57BL/6J | JmsSlcJapan SLC | RRID: MGI:5488963 |
| Mouse Slc:ICR | Japan SLC | RRID: MGI:5462094 |
| Mouse: SRR42-KO | This paper | N/A |
| Mouse: SRR42-2 kb lacZ reporter | This paper | N/A |
| 寡核苷酸 | | |
| Primers for construction | FASMAC | Table S1 |
| Primers for genotyping PCR | FASMAC | Table S1 |
| Primers for RT-qPCR | FASMAC | Table S1 |
| crRNA for deficient mice | Integrated DNA Technologies (IDT) | Table S1 |
| 重组 DNA | | |
| Hsp68-LacZ-Gateway | Addgene | Plasmid #37843 |
| pENTR/D-TOPO vector | Thermo Scientific | K240020S |
| Hsp68-LacZ-SDRE_transgene_2k | This study | N/A |
| pCAGGS-mRFP | Kind gift from Dr. Ayako Y. Murayama (Keio Univ.) | N/A |
| pCAGGS-mEGFP | Kind gift from Dr. Ayako Y. Murayama (Keio Univ.) | N/A |
| AAV-EFS-NLS-CasRx-U6-DR-sgRNA_LacZ-DR | Addgene | Plasmid #154003 |
| AAV-EFS-NLS-CasRx-U6-DR-sgRNA_SDRE_1-2-DR | This study | N/A |
| 软件和算法 | | |
| Imaris (11.0) | Oxford Instruments | RRID: SCR_007370 |
| ZEN microscopy software (v3.10) | Carl Zeiss | RRID: SCR_013672 |
| Design and Analysis (2.8.0) | Thermo Fisher Scientific | RRID: SCR_026962 |
| Compass for SW (6.3.0) | ProteinSimple (Bio-Techne) | https://www.bio-techne.com/ |
| Integrative Genomics Viewer (IGV; v2.8.11) | Broad Institute | https://www.bio-techne.com/ |
| Cell Ranger ARC (v2.0.0) | 10× Genomics | https://support.10xgenomics.com/ |
| R (v4.1.3, or v4.4.1) | R Foundation | RRID: SCR_001905; https://www.r-project.org/ |
| Bioconductor | Bioconductor Project | RRID: SCR_006442; https://bioconductor.org/ |
| Seurat (v4.0.3, or v5.2.1) | Satija Lab | RRID: SCR_016341; https://satijalab.org/seurat/ |
| Signac (v1.0.3, or v1.14.0) | Stuart Lab | RRID: SCR_021158; https://stuartlab.org/signac/ |
| Monocle 3 (v1.0.0) | Trapnell Lab | RRID: SCR_018685; https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/ |
| GenomicRanges | Stuart Lab | RRID: SCR_000025 |
| BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm10 (v1.4.3) | Bioconductor; UCSC | https://bioconductor.org/packages/BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm10 |
| EnsDb.Mmusculus.v79 (v2.99.0) | Bioconductor; Ensembl | https://bioconductor.org/packages/EnsDb.Mmusculus.v79 |

实验模型和研究参与者详情
动物
所有实验程序均按照庆应义塾大学医学院实验动物护理委员会（17038 和 09091）、山形大学医学院分子遗传学研究中心（31-78）、早稻田大学人文科学院（A25-122）和福井大学生命科学研究实验室（R03090）批准的指南进行。C57BL/6J 和 ICR 小鼠购自日本 SLC（静冈，日本）。动物在 12 小时光/暗周期下饲养，食物和水自由取食。通过杂交杂合雄性和雌性小鼠获得定时妊娠，研究利用 E10.5、E11.5、E12.5、E14.5、E16.5、E17.5 和 E18.5 的胚胎小鼠，以及 P0 和 P8 的出生后小鼠，不区分性别。小鼠通过颈椎脱臼处死。麻醉通过吸入异氟烷或腹腔注射包含美托咪酯（0.75 mg/kg）、咪达唑仑（4 mg/kg）和布托啡诺（5 mg/kg）的三合一麻醉剂混合物诱导。

细胞培养
原代皮层神经元使用从性别未确定的 E14.5 胚胎小鼠收获的大脑皮层制备。解离细胞在铺有 poly-ornithine 和纤连蛋白的培养皿中，在补充有 2% B-27 Supplement 和 1× GlutaMAX 的 DMEM/F12 培养基中培养。对于人类细胞实验，使用源自人诱导多能干细胞（hiPSC）系 YZWJs513 的神经球。hiPSC 系由京都大学 iPS 细胞研究与应用中心（CiRA）提供，并按先前描述的方法通过传代维持。本研究未建立新的 hiPSC 系。hiPSC 系使用 STR 谱分析进行鉴定，并由供应商（CiRA）确认为无支原体。

方法细节
质粒构建
使用从 C57BL/6J 野生型（WT）小鼠提取的基因组 DNA 作为模板，通过 PCR 扩增对应于 SRR42 区域的增强子区域。然后将扩增片段克隆到 pENTR/D-TOPO 载体（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中。随后，利用 LR 重组反应（Thermo Fisher Scientific），将包含 SRR42 区域的插入片段转移到 Hsp68-lacZ-Gateway 载体（#37843; Addgene, Watertown, MA, USA）中，生成 SRR42-2 kb lacZ 报告基因质粒。对于靶向来自 SRR42 区域的 RNA 的敲低实验，我们使用质粒载体 AAV-EFS-NLS-CasRx-U6-DR-sgRNA_LacZ-DR（#154003; Addgene），其表达 CasRx 和 LacZ sgRNA。sgRNA 靶序列使用 siDirect 算法（http://sidirect2.rnai.jp/）选择。引物和 gRNA 序列的详细信息提供在表 S1 中。

报告基因和敲除（KO）小鼠的生成
为了生成 SRR42-2 kb lacZ 报告基因小鼠，通过限制性酶切从报告基因质粒中切除 lacZ 报告片段，随后纯化。

纯化的片段被显微注射到受精的 C57/BL×DBA2 F1 (BF1) 合子的原核中。转基因小鼠的基因型鉴定通过 PCR 进行，引物序列列于表 S1。为了生成 SRR42-KO 小鼠，采用电穿孔动物敲除系统技术 (TAKE) 方法对 C57BL6/J 小鼠的体外受精卵进行基因组编辑。基因组编辑组分，包括 crRNA、tracrRNA 和 Cas9 蛋白，购自 Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA)。crRNA 的靶位点使用 CRISPOR 算法设计 (http://crispor.tefor.net/crispor.py)，相应的序列见表 S1。在四个独立生成的突变品系中，选择了第 3 号和第 5 号品系进行进一步分析。表型研究中使用的所有 KO 小鼠均经过至少四代回交至 C57BL/6J 背景。由于第 3 号和第 5 号品系之间的表型相似 (图 S3D)，后续分析中合并了两个品系的数据。

BrdU 检测
为了评估体内的细胞增殖，如前所述，在 E14.5 时给妊娠雌鼠腹腔注射 5-溴 -2-脱氧尿苷 (BrdU; 50 mg/kg, Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)。通过交配杂合 SRR42-KO 雄性和雌性小鼠获得定时妊娠。从包含 WT 和突变后代的胎仔中收集大脑样本。分析每种基因型的三个大脑以确保采样一致。

体内电穿孔
为了进行子宫内基因敲低，制备了含有 RfxCas13d 敲低载体 (5 μg/μL) 和用于荧光标记的 pCAGGS-mRFP 载体 (5 μg/μL) 的 DNA 溶液，体积比为 1:4。混合液使用玻璃毛细管 (GD-1; NARISHIGE, Setagaya, Japan) 在 E14.5 时注射到胚胎 C57BL/6J 小鼠的脑室中。电穿孔使用连接到脉冲发生器 (CUY21, Nepa Gene) 的铂电极 (CUY650P5; Nepa Gene, Ichikawa-City, Chiba, Japan) 进行，传递六个周期的 35 V 电脉冲，每个脉冲持续 50 ms，脉冲间隔 950 ms。电穿孔后，将子宫重新置于腹腔内，并进行外科缝合切口。胚胎在 E16.5 时收集用于进一步分析。

体外电穿孔
采集 E14.5 小鼠的脑皮层，通过移液将细胞解离并通过细胞筛。然后使用 Mouse Neuron Nucleofector Kit 和 Nucleofector 2b 设备 (Lonza, Basel, Switzerland)，以 9:1 的比例用电穿孔法将细胞与 RfxCas13d 敲低载体或对照载体以及 pCAGGS-EGFP 混合。转染后，细胞在包被聚赖氨酸和纤连蛋白的皿中，用补充了 2% B-27 添加剂和 1× GlutaMAX (均购自 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 的 DMEM/F12 培养基 (Fujifilm Wako, Osaka, Japan) 培养 48 小时。然后使用 SH800 流式细胞仪 (Sony, Tokyo, Japan) 分选 EGFP 阳性细胞，通过碘化丙啶 (PI) 染色排除死细胞。

整体骨骼染色
收获 E17.5 胚胎并小心解剖以去除皮肤、内脏器官和脂肪组织。标本在室温下用 95% 乙醇固定 5 天，然后浸入丙酮中 2 天。染色使用含有 0.3% 固蓝 8 GS (溶于 70% 乙醇)、0.1% 碱性复红 S (溶于 95% 乙醇)、乙酸和 70% 乙醇 (混合比为 1:1:1:17) 的溶液进行。染色过程在 37°C 下进行 3 天。用蒸馏水洗涤后，标本在 1% KOH 中透明化 48 小时，然后在室温下依次在含有 20%、50% 和 80% 甘油的 1% KOH 溶液中脱水 24 小时。最后，标本在室温下用 100% 甘油保存 20 天。

X-Gal 染色
胚胎用含有 2% 甲醛、0.2% 戊二醛和 0.01% NP-40 的冰 PBS 固定。固定时间根据发育阶段调整：E10.5 为 10 分钟，E11.5 为 20 分钟，E12.5 和 E14.5 胚胎为 30 分钟。然后用含有 0.05% Tween 20 的 PBS 对胚胎进行透化 15 分钟。使用 1× X-Gal 溶液 (AMSBIO, Abingdon, UK) 在 37°C 下进行 X-Gal 染色，直到获得最佳信号。反应通过浸入含有 4% 多聚甲醛 (PFA) 的 PBS 中终止。为了透明化，E12.5 胚胎依次用 PBS 中的 10%、20%、50% 和 80% 甘油处理 (各 12 小时)。对于 E14.5 胚胎，大脑在 20% 蔗糖中进行低温保护，包埋在 OCT 化合物中 (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)，并使用 CM3050S 冷冻切片机 (Leica Biosystems, Nussloch, Germany) 切片至 12 μm。

免疫组织化学
收集 E14.5、E16.5 和 P8 小鼠的大脑并用 PBS 中的 4% PFA 固定。胚胎大脑在 4°C 下固定 5 小时。P8 大脑固定过夜。在 4°C 下用 PBS 中的 20% 蔗糖低温保护过夜后，大脑包埋在 OCT 化合物中并切片至 12 μm 厚。为了抗原修复，切片在柠檬酸盐缓冲液 (Dako Target Retrieval Solution, Citrate pH 6; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 中于 105°C 高压灭菌 15 分钟。切片在含有 0.1% Triton X-100 的 Blocking One (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) 中于室温下透化 1 小时。一抗稀释于 Blocking One 中并在 4°C 下孵育过夜。然后二抗和 Hoechst 33258 稀释于 Blocking One 中并在室温下孵育 1 小时。β-Gal 抗体染色使用 Power Styramide Signal Amplification (PSA) 配合 iFluor? 555 Tyramide (AAT Bioquest, Pleasanton, CA, USA) 进行。所用抗体的详细信息见表 S2。

使用 simple western 系统的免疫印迹分析
为了样品制备，将 E14.5 小鼠的脑皮层裂解并在含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、0.1% SDS、1% Triton X-100、0.1% 去氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 缓冲液 I 中匀浆 (Nacalai Tesque)。裂解液随后使用 Bioruptor (Diagenode, Denville, NJ, USA) 进行破坏。我们使用 Simple Western 系统 (ProteinSimple, San Jose, CA, USA) 分析蛋白质表达，这是一种非凝胶基的、自动化的毛细管 Western blot 类似替代品。样品、抗体和试剂的制备以及实验程序均按照 ProteinSimple 用户手册进行。自动分离电泳和化学发光检测由仪器执行，生成的数字化学发光图像使用 Compass 软件 (ProteinSimple) 进行分析。为了定量分析，将 Sox2 的峰面积相对于 Gapdh 进行标准化。关于一抗的详细信息总结于表 S2。

RNA 纯化及逆转录 - 定量 PCR (RT-qPCR) 分析
总 RNA 按照制造商的方案，使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden Germany) 或 TRI Reagent (Sigma–Aldrich, St Louis, MO, USA)，或 mirVana miRNA 分离试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 提取。cDNA 使用 ReverTraAce 逆转录试剂盒 (TOYOBO, Osaka, Japan) 在 ezDNase 酶 (Thermo Fisher Scientific) 处理后合成。qPCR 使用 Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) 在 ViiA7 实时 PCR 系统 (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) 上进行。为了确认不存在基因组 DNA 污染，非逆转录样本同时通过 qPCR 进行分析。引物序列列于表 S1。

单细胞多组学 (snRNA-Seq 和 snATAC-Seq)
从 E14.5 WT 和 KO 同窝胚胎的皮质组织中制备了单细胞 Multiome ATAC + 基因表达文库 (v1, 10× GENOMICS)。细胞核分离和文库制备按照 10× Genomics 方案进行。使用 Cell Ranger ARC (version 2.0.0, 10× GENOMICS) 进行解复用、比对、过滤、条形码计数、峰调用以及 RNA-Seq 和 ATAC-Seq 读数的计数。为了最小化数据集中的性别差异，在运行 Cell Ranger ARC 之前准备了排除 XY 染色体信息的小鼠参考基因组 mm10。使用约 6,000 个 WT 和 5,000 个 KO 细胞核进行加权最近邻 (WNN) 分析。分析流程包括使用 Seurat (v4.0.3 和 v5.2.1) 和 Signac (v1.0.3 和 v1.14.0) (https://satijalab.org/seurat/articles/weighted_nearest_neighbor_analysis)。应用 SCtransform 来标准化 RNA 计数，并使用词频 - 逆文档频率 (TF-IDF) 来标准化 ATAC 峰。整合两种模态的 WNN 图用于 UMAP 可视化和聚类。差异表达基因 (DEG) 分析使用 Seurat 中的 FindMarkers 函数进行。基因本体 (GO) 富集分析通过 g:Profiler (https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 使用 DEG 数据进行。使用 g:Profiler 提供的默认统计背景，对应于 Ensembl 数据库中的所有注释 Mus musculus 基因。

整合伪时间分析
使用 Monocle3 对整合对象进行伪时间推断。原始 RNA 计数矩阵和细胞元数据用于构建 cellDataSet 对象，直接保留来自 Seurat 的聚类分配和 WNN UMAP 坐标。为了保持连续的拓扑结构，在所有细胞上构建单个主图而不进行分区。通过定义特定的结构节点 (指定为图 S11B 中的点 1) 作为发育根来计算伪时间。为了评估野生型 (WT) 和敲除 (KO) 轨迹之间的细胞命运分布，我们量化了代表发育过渡的关键主图节点 (点 1-3) 的细胞占据情况。具体而言，统计每个目标节点径向距离 0.8 UMAP 单位内的细胞，并相对于相应基因型的总细胞数进行标准化。使用这种标准化频率来比较推断的分化轨迹上 WT 和 KO 细胞的分布。

多模态标签转移
为了从 ATAC 数据估计基因水平的转录活性，使用 Seurat 中的 GeneActivity 函数计算基因活性得分。这些得分作为新的 'ACTIVITY' 测定整合到 Seurat 对象中，随后使用 10,000 的缩放因子进行 log 标准化。为了从现有的 RNA 注释预测基于 ATAC 的细胞类型，使用 FindTransferAnchors 函数识别模态之间的转移锚点。此步骤利用典型相关分析 (CCA) 进行降维，将 SCT 标准化的 RNA 测定设置为参考，将 'ACTIVITY' 测定设置为查询。然后使用 TransferData 函数生成细胞类型预测，提供 RNA 注释的聚类作为参考数据，并利用潜在语义索引 (LSI) 分量 (维度 2 到 30) 进行降权。为了评估这些跨模态细胞类型预测的准确性，构建了一个混淆矩阵，比较注释的 RNA 细胞类型与预测的 ATAC 细胞类型。为了靶向分析，将"NSC_M"和"NSC"聚类合并为单个"NSC_M + NSC"组，数据计算为按列比例以反映每个 RNA 注释聚类的预测 ATAC 身份比例。最后，分析限制于相关聚类的特定子集 ("NSC_M + NSC", "SVZ", "Layer V-VI", "Layer II-IV", 和 "Layer I"), 并将生成的转移准确性矩阵使用 ggplot2 和 viridis 色标可视化为热图。

基因表达帽分析 (CAGE)-Seq
来自三个 WT E14.5 胚胎的皮质组织和源自人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) YZWJs513 的神经球，由京都大学 iPS 细胞研究与应用中心 (CiRA) 提供，用于 CAGE。神经球通过进行八次传代使用先前报道的方法获得。使用 Bioanalyzer (Agilent) 确认 RNA 完整性 (RIN >7.0)。CAGE 文库制备、测序、比对和基因表达分析由 K.K. DNAFORM (Yokohama, Japan) 进行。cDNA 使用随机引物从总 RNA 合成，并且 5' 帽结构被生物素化。然后生物素化的 RNA/cDNA 通过链霉亲和素珠进行选择。在 RNA 消化和接头连接后，构建双链 cDNA 文库并在 NextSeq 2000 平台 (Illumina, San Diego, CA, USA) 上进行测序。生成的读数使用 STAR 比对到小鼠 mm10 或人类 hg38 基因组。使用 CAGEr 的 Paraclu 算法对 CAGE 标记数据进行聚类。对于小鼠样本，丢弃每百万计数 (CPM) 低于 0.2 的聚类，而对于人类样本，丢弃 CPM 低于 0.1 的聚类。

图像分析和定量
使用 LPE-06BK 成像系统 (SANWA SUPPLY, Okayama City, Japan) 捕获小鼠的整体胚胎和大脑图像。使用共聚焦显微镜 (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)、荧光显微镜 (BZ-X810, KEYENCE, Osaka, Japan) 或成像细胞仪 (CQ1, Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan) 对薄切片标本进行成像。使用从同窝小鼠收集的 2 到 3 个大脑，从每个大脑内的三个不同位置获取切片标本的图像。使用抗 Cleaved-Caspase3 抗体在 P0 组织切片中评估嗅球 (OB) 的细胞死亡。定量 Cleaved-Caspase3 阳性细胞的数量并相对于切片面积进行标准化 (表示为 cells/mm2)。

同样地，Tbr2+/PH3+双阳性细胞的密度是通过将细胞计数除以分析面积来确定的。为了确保野生型（WT）和敲除型（KO）之间的可比性，基于 Hoechst 复染，沿嗅球（OB）的前后轴对切片进行解剖学匹配。对于 BrdU 检测，在 E14.5 注射 BrdU 后，收集 P8 小鼠大脑。将皮层 II–VI 层分为 10 个大小相等的区室，其中位于第四层一侧的区室指定为 BIN1。计算每个区室中的 BrdU+ 细胞数量，并表示为总数的百分比。对于 PH3 染色，通过计算背侧皮层中排列在室管膜表面的 PH3+ 细胞数量（称为“室管膜表面 [VS]"）或位于大脑皮层室管膜表面以外的 PH3+ 细胞数量（称为“非表面 [NS]"）来量化细胞增殖。然后将这些计数用室管膜表面的长度进行归一化。对结果取平均值，以计算背侧皮层每 μm 室管膜表面的 PH3+ 细胞密度。E14.5 时 WT 和 KO 的 Tbr2 定位分析是通过将 VZ 中存在的 Tbr2 阳性细胞数除以 Tbr2 阳性细胞总数来计算的。此外，将 VZ 分为 1-3 区室（BIN1-3），并计算 Tbr2 在 VZ 内的占据比例。对于敲低分析，选择表现出高数量荧光标记细胞的切片。然后用室管膜区中标记细胞的数量除以标记细胞总数，以确定标记细胞的比例。为了分析表达 Sox2 的细胞，我们比较了 WT 和 KO 之间皮层中 Sox2 阳性细胞的比例及其个体表达水平。该比例是通过将 Sox2 阳性细胞的数量相对于 Hoechst 总计数进行归一化来确定的。为了量化每个细胞的表达水平，使用恒定的曝光和增益设置捕获图像；测量总荧光强度，并根据强度对细胞进行分割，以计算每个细胞的任意单位（A.U.）平均值。使用抗 Cleaved-Caspase3 抗体在 P0 组织切片中评估嗅球（OB）中的细胞死亡。对 Cleaved-Caspase3 阳性细胞的数量进行量化，并相对于切片面积进行归一化（表示为 cells/mm2）。同样地，Tbr2+/PH3+双阳性细胞的密度是通过将细胞计数除以分析面积来确定的。为了确保野生型（WT）和敲除型（KO）之间的可比性，基于 Hoechst 复染，沿嗅球（OB）的前后轴对切片进行解剖学匹配。使用 Imaris 软件（Oxford Instruments, Abingdon-on-Thames, UK）对抗体染色的阳性细胞进行检测和强度量化。具体而言，采用"Spots"功能来识别和指定阳性细胞，而使用"Surface"功能进行信号强度的详细分析。

量化和统计分析

在箱须图中，黑线代表中位数，而灰线或白线表示平均值。箱体的下边界和上边界分别代表第 25 百分位和第 75 百分位数据。须线延伸至最极端的数据点，排除任何异常值。实际数据值以圆圈绘制。为了控制 Simple Western 数据中潜在的窝间差异，使用线性模型（R 中的 lm 函数），以基因型为主要因子，以窝（母亲）为区组因子。使用双尾 Student's t 检验、Tukey–Kramer 检验、Welch's t 检验、配对 t 检验和 II 型方差分析（ANOVA）来分析统计显著性。显著性水平用星号表示：?p < 0.05；??p < 0.01；???p < 0.001；????p < 0.0001。

补充信息 (1)PDF (2.42 MB) 文档 S1. 图 S1–S15 和表 S1 和 S2