心脏三级免疫微环境驱动免疫检查点抑制剂心肌炎中的免疫激活

《SCIENCE ADVANCES》：Cardiac tertiary immune niches drive immune activation in immune checkpoint inhibitor myocarditis

免疫检查点抑制剂（ICI）心肌炎是癌症免疫治疗中一种罕见但常致命的不良事件。理解该毒性的机制对于平衡治疗与维持抗肿瘤免疫至关重要。研究人员在药理学小鼠模型中利用整合的空间和单细胞分析，鉴定了心脏中Ly6C⁺单核细胞和PD-1⁺ CD8⁺ T细胞的区域性浸润，这些细胞组织成富含成纤维细胞的免疫结构，研究人员将其称为三级T细胞微环境（TTCNs）。TTCNs作为T细胞激活的中枢，具有三级淋巴结构的特征。在ICI心肌炎患者的心脏组织中，TTCN基因特征显著富集。互补的T细胞受体分析揭示了ICI治疗后心脏T细胞的克隆扩增。研究人员进一步确定了TTCN相关细胞因子和结构蛋白作为减少心肌炎症同时考虑肿瘤控制的候选治疗靶点。总之，这些发现表明心脏三级免疫结构在ICI心肌炎中发挥核心作用，并强调了可能减轻ICI心脏毒性的通路。

**论文解读：心脏三级免疫微环境在免疫检查点抑制剂心肌炎中的作用机制**

**一、研究背景与科学问题**

免疫检查点抑制剂（ICIs）通过增强T细胞抗肿瘤反应彻底改变了癌症治疗格局，超过50%的晚期或转移性癌症患者符合ICI治疗条件，但其中约半数会出现免疫相关不良事件（irAEs）。约1%接受ICI治疗的患者会发生心肌炎，这是一种罕见但异质性强的irAE，死亡率高达约40%。目前ICI心肌炎的主要治疗策略是停用ICI并给予大剂量糖皮质激素，但该疗法对部分患者疗效有限，且可能削弱抗肿瘤免疫应答。因此，阐明驱动ICI心肌炎的细胞和分子机制对于平衡治疗与维持抗肿瘤免疫至关重要。既往研究已提示活化克隆性T细胞和炎性巨噬细胞参与ICI心肌炎发生，但驱动T细胞在心脏中扩增、迁移和驻留的精确免疫机制，以及T细胞与心脏微环境中其他细胞成分的空间关系仍不清楚。免疫细胞常在组织中形成功能性空间排列，如淋巴结中T细胞围绕抗原提呈细胞聚集，或在自身免疫靶组织中围绕血管分布，这些排列构成免疫激活或抑制的关键局部微环境。在肿瘤和自身免疫疾病中，生发中心样结构中的局部自身反应性T细胞、B细胞和自身抗体的产生被称为三级淋巴结构（TLSs）。然而，TLSs及空间免疫景观在ICI心肌炎中的作用尚未阐明。

**二、研究设计与关键技术方法**

研究人员采用药理学小鼠模型（A/J小鼠，部分荷瘤NXS2细胞），通过腹腔注射抗PD-1和抗CTLA-4单克隆抗体诱导心肌炎，并整合多项关键技术：（1）多参数光谱流式细胞术分析心脏和外周血免疫细胞表型；（2）CosMx空间分子成像仪（SMI）进行空间转录组学，结合无监督聚类和生态位分析定义细胞微环境；（3）配对单细胞RNA测序（scRNA-seq）和T细胞受体（TCR）测序评估克隆扩增和转录特征；（4）bulk TCRβ CDR3测序分析克隆多样性；（5）CellChat分析推断细胞间配体-受体通讯；（6）人源ICI心肌炎样本和公共数据集（GSE228597等）验证。样本包括小鼠心脏、外周血、肿瘤组织，以及一例ICI相关心包心肌炎患者的心包液和外周血。

**三、主要研究结果**

**ICI治疗诱导心脏中组织化异位免疫结构的形成**：通过组织学和多重免疫荧光染色，研究人员发现ICI治疗显著增加心脏CD3⁺和CD8⁺ T细胞浸润（荷瘤和非荷瘤条件下均如此），且炎症灶主要位于心外膜和心内膜区域。空间距离分析显示CD68⁺髓系细胞与CD8⁺ T细胞距离更近，形成密集聚集体，而非炎性心脏中免疫细胞稀疏弥漫。这种空间组织在肿瘤组织中呈现不同模式，提示心脏和肿瘤具有环境依赖性免疫架构差异。

**CD69⁺ PD-1⁺ CD8⁺ T细胞在ICI治疗心脏中特异性富集**：通过多参数流式细胞术，研究人员发现ICI治疗导致心脏中单核细胞和树突状细胞（DCs）显著增加，并鉴定出心脏特异的CD8⁺ CD69⁺ PD-1⁺效应记忆T细胞亚群，表达CXCR3、LAG-3和TIM-3。该群体在外周血中未富集。患者心包液中也检测到类似PD-1⁺ CD8⁺效应记忆细胞，公共scRNA-seq数据进一步验证了ICI心肌炎患者心脏中该群体的富集。

**ICI治疗驱动DCs和Ly6C⁺炎性单核细胞浸润心脏**：ICI治疗后心脏中DCs和Ly6C单核细胞亚群（经典、中间、非经典）均增加，以Ly6C^int中间单核细胞富集最为显著。心脏DCs上调PD-L1表达，心脏浸润的Ly6C^int单核细胞MHCII表达高于外周血。患者心包液中间单核细胞也显示HLA-DR和PD-L1表达升高。人源scRNA-seq数据中鉴定出表达HLA基因、CD74和促炎趋化因子（CXCL9、CCL2、CCL8）的中间单核/巨噬细胞样群体。

**协调的免疫-基质微环境塑造心脏免疫激活并具有TLS特征**：空间转录组学分析在炎性心脏中鉴定出四个离散细胞微环境，包括T细胞丰富微环境（命名为三级T细胞微环境，TTCN）、内皮/血管微环境、NK细胞微环境和心肌细胞丰富免疫贫乏微环境。TTCN主要位于心内膜和心外膜区域，T细胞、髓系细胞和成纤维细胞紧密互作。TTCN中的T细胞表达激活标志物（Cd28、Cd69、Pdcd1），共定位髓系细胞高表达抗原提呈基因（H2-Ab1、H2-K1、Cd74）和趋化因子配体，成纤维细胞呈现免疫表型，表达MHC基因和炎症介质（Osm、Il6st）。内皮细胞高表达高内皮微静脉（HEV）相关基因（Ccl21a/b/d、Cxcl9）和白细胞粘附分子（Icam1、Vcam1）。

**TTCN基因特征在人类ICI心肌炎中升高**：研究人员构建了包含32个基因的TTCN评分，涵盖T细胞增殖（Cd44、Hmgb2等）、抗原提呈（H2-Aa、Ciita等）、免疫细胞招募（Ccl5、Cxcl9等）、结构组织（Icam1、Itgb2等）和纤维化（Col1a1、Lum等）相关基因。该评分在人类ICI心肌炎心脏组织中显著高于对照组，在致死性病例中均高于队列中位数。外周血中TTCN评分在免疫抑制治疗前也升高，但经类固醇治疗后呈下降趋势。TTCN评分在另一个ICI心肌炎小鼠模型（PD-1^-/- MRL小鼠）中同样升高，但在病毒性心肌炎模型中未升高，表明该特征特异于ICI相关心脏炎症。

**TTCN评分聚类揭示炎性心脏区域内的异质性微结构域组织**：通过Orange数据挖掘的细胞邻域聚类分析，非炎性区域表现为稀疏弥散的微簇结构，免疫细胞散在分布；而高TTCN评分的炎性区域出现T细胞、Cd74⁺髓系细胞和成纤维细胞组成的致密连接网络，形成空间受限的微结构域，部分呈现类似缺乏B细胞的淋巴样聚集特征。

**心脏T细胞克隆扩增并呈现PD-1⁺干样特征**：bulk TCRβ测序显示ICI治疗心脏中TCR模板丰度和克隆扩增增加，库向有限数量的高扩增克隆倾斜。单细胞TCR测序显示CD8⁺细胞毒性和CD4⁺ TH1群体扩增最强，扩增克隆高表达激活相关基因（Nkg7、Cxcr6、Pdcd1、S100a家族）和长链非编码RNA AW112010。扩增的CD8⁺ T细胞表达Tcf7，低表达耗竭标志物（Tox、Havcr2），呈现干样表型。

**趋化因子信号通路在炎性心脏异位免疫结构形成中发挥核心作用**：CellChat空间分析显示TTCN中T细胞、髓系细胞和成纤维细胞间存在强相互作用，涉及MHC-I、CXCL、CCL、ICAM、ICOS和TNF信号通路。预测的关键配体-受体对包括髓系/成纤维细胞表达的Cxcl16与T细胞Cxcr6、Cxcl9与Cxcr3、T细胞Ccl5与成纤维细胞Ccr5、Ccl19-Ccr7轴等。人类ICI心肌炎心脏中同样存在CCL5-CCR1、CXCR3-CXCL9、CXCR6-CXCL16等通路。TCGA生存分析显示CXCR3、CXCR9和CCR5表达与较好总生存相关，而CXCL16、CCL8和MIF与中性或较差生存相关。

**阻断CXCL16未减轻心脏炎症但保留抗肿瘤反应**：鉴于CXCR6-CXCL16信号的突出作用，研究人员测试了CXCL16阻断，结果显示对心肌炎症（肌钙蛋白、T细胞浸润、纤维化）无显著改善，但保留了抗肿瘤反应和肿瘤浸润T细胞的颗粒酶介导细胞毒性。体外实验中，抑制LFA-1、B7、CCL8、MIF和CCR5可减弱OT-1和A/J脾细胞活化。

**四、总结与讨论**

本研究表明ICI治疗主要促进心外膜和心内膜区域CD69⁺ PD-1⁺ CD8⁺ T细胞、DCs、炎性Ly6C⁺单核细胞和单核细胞来源巨噬细胞的浸润，这些细胞组织成空间定义的簇，免疫成纤维细胞作为致病信号传导和损伤的焦点。虽然结构缺乏成熟生发中心和丰富B细胞，不能定义为成熟TLS，但TTCN表达成熟TLS相关趋化因子配体和抗原提呈基因，发挥T细胞激活和增殖功能。PD-1⁺ T细胞并非典型耗竭状态，而是呈现活化、细胞毒性和干样表型。心脏和肿瘤中TCR扩增模式存在差异，提示ICI可能直接破坏心脏外周耐受机制。靶向单一趋化因子（如CXCL16）效果有限，提示存在冗余通路，靶向上游JAK/STAT信号（如ruxolitinib）或CD28共刺激（abatacept）可能更有效。研究局限性包括：所用NXS2细胞系为杂交细胞系可能引发同种异体反应；空间转录组学聚焦于炎症最严重小鼠；遗传模型缺乏胸腺PD-1表达可能不完全模拟患者情况。

**研究结论**：ICI心肌炎不应视为单一免疫现象，而是T细胞、髓系细胞和成纤维细胞等多种特异性细胞在动态心脏微环境微生态位中相互作用，驱动强烈T细胞克隆增殖的复杂过程。有效治疗策略应同时干扰多个致病回路，同时考虑对抗肿瘤免疫的影响。本研究首次描述ICI相关心肌炎中的三级免疫结构，为理解该疾病机制和开发靶向治疗提供了新视角。该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。