天麻素通过抑制PRMT1激活AMPK信号通路缓解脑缺血-再灌注损伤

《Brain Research》：Gastrodin activates the AMPK signaling pathway by inhibiting PRMT1 to alleviate cerebral ischemia–reperfusion injury

　　

脑缺血-再灌注损伤（CIRI）病理过程的复杂性严重阻碍了当前治疗方法的成功。本研究探讨天麻素（Gastrodia elata Blume的主要生物活性代谢物）是否通过调节脑微血管内皮细胞（BMEC）功能缓解CIRI。研究人员对小鼠实施短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO），对人BMEC施加氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）进行建模。天麻素剂量依赖性地改善OGD/R诱导的BMECs氧化应激与铁死亡（ferroptosis），并促进BMECs迁移与血管生成。蛋白精氨酸N-甲基转移酶1（PRMT1）是天麻素在BMECs中的下游蛋白，天麻素通过介导PRMT1蛋白不稳定性加速其降解。外源性过表达PRMT1削弱天麻素体内外保护作用。天麻素以PRMT1依赖方式激活BMECs中AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号，AMPK信号抑制剂dorsomorphin减弱天麻素的保护效应。研究结果表明，天麻素通过抑制BMECs中PRMT1蛋白表达激活AMPK信号，从而改善BMECs铁死亡与功能障碍，缓解CIRI。

研究背景与立项依据

脑缺血-再灌注损伤（CIRI）是指在局灶性脑缺血后恢复血流所触发的一系列有害细胞与生化过程，即便实现完全再通仍可导致梗死扩展与不良预后。血-脑屏障（BBB）由脑内皮细胞与周细胞、星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞及血管周围巨噬细胞相互作用构成，维持BBB完整性对中枢神经系统稳态至关重要。天麻（Gastrodia elata Blume）用于脑血管意外与“风”所致头痛已有千年历史，天麻素作为其首要生物活性代谢物，具备抗炎、抗氧化与血管保护等药理作用。已有报道显示天麻素可减轻人脐静脉内皮细胞氧化应激诱导的凋亡与功能障碍，但其在CIRI所致脑微血管内皮细胞（BMEC）损伤中的治疗作用尚不清楚。CIRI病理使细胞对氧化应激易感性增加、ATP生成下降，进而诱发铁死亡（ferroptosis）；天然铁死亡抑制剂在CIRI神经元保护中已显疗效。蛋白精氨酸N-甲基转移酶1（PRMT1）属I型蛋白精氨酸甲基转移酶，近期被提示促进脓毒症相关急性肺损伤中的铁死亡。AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号激活可有效减轻脑组织损伤并抑制铁死亡，且天麻素在非酒精性脂肪性肝炎中经激活AMPK发挥保护作已被证实。基于此，研究人员假设天麻素通过抑制PRMT1激活AMPK信号保护BMECs抵御CIRI。该论文发表于《Brain Research》。

主要关键技术方法概括

研究人员采用体内外联合研究设计。体外以人BMECs（CP-H124）为对象，经氧-糖剥夺/复氧（OGD/R）模拟CIRI内皮损伤，并以梯度浓度天麻素预处理，辅以PRMT1过表达质粒及AMPK抑制剂dorsomorphin干预；通过CCK-8、成管实验、划痕实验、跨内皮电阻（TEER）与FITC-葡聚糖渗漏评估活力、血管生成、迁移及屏障功能，以Western blot、RT-qPCR、免疫荧光、JC-1染色、电镜及生化试剂盒检测PRMT1/AMPK/铁死亡相关指标与线粒体状态，并以环己酰亚胺（CHX）追踪PRMT1蛋白稳定性。体内选用8周龄雄性C57BL/6小鼠，经短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）建立CIRI模型，术后灌胃50、100、200 mg/kg天麻素或尾静脉射3 mg/kg依达拉奉（edaravone）阳性对照，经尾静脉预注AAV-br1-PRMT1特异性在脑微血管内皮过表达PRMT1；通过Bederson评分、转棒与爬杆试验评估神经功能，TTC染色测算梗死体积，Evans蓝外渗与脑微血管富集后生化/Western blot/免疫荧光（CD31）评价BBB完整性、氧化应激与微血管蛋白表达。

研究结果

3.1 天麻素改善OGD/R诱导的BMEC损伤与功能障碍

CCK-8确认≤80 μM天麻素对BMEC活力无影响。OGD/R降低BMEC活力、成管能力、迁移率、TEER并增加FITC-葡聚糖渗漏，伴ZO-1与Occludin荧光减弱；天麻素20、40、80 μM预处理浓度依赖性地逆转上述改变，恢复紧密连接蛋白表达与屏障功能。

3.2 天麻素降低OGD/R诱导的BMECs氧化应激与铁死亡

DCFH-DA显示OGD/R升ROS，天麻素抑ROS并回抬SOD与GSH、降MDA。Western blot示OGD/R降GPX4、SLC7A11并升ACSL4，天麻素反向调节；天麻素抑游离Fe²⁺蓄积，透射电镜见线粒体肿胀嵴消失比例下降，JC-1红聚集体恢复。铁死亡抑制剂（Liproxstatin-1、Ferrostatin-1）与凋亡抑制剂均缓OGD/R损伤，但铁死亡诱导剂（Erastin、RSL3、FIN56）完全取消天麻素保护，提示天麻素主通过抑铁死亡起效，80 μM为后续用量。

3.3 天麻素降低PRMT1蛋白稳定性与蛋白表达

取GSE131193微血管转录组差异基因、Super-PRED预测天麻素靶标与GeneCards“内皮功能障碍”基因交集得PRMT1、SERPINE1、NR3C2；WB示OGD/R升PRMT1与SERPINE1、降NR3C2，天麻素显著降PRMT1蛋白且不改SERPINE1/NR3C2。AutoDock Vina对接结合能<?6 kcal/mol。RT-qPCR示天麻素不改PRMT1 mRNA，CHX追踪示天麻素缩短PRMT1半衰期，证明转录后不稳定性介导降解。

3.4 PRMT1过表达逆转天麻素对BMECs的保护

CMV-PRMT1转染升PRMT1并抑ZO-1、Occludin、GPX4，削弱天麻素对活力、成管、迁移、TEER的改善，升通透性与ROS、乱抗氧化平衡、加重线粒体损伤，证实PRMT1位于天麻素下游负向节点。

3.5 天麻素激活AMPK信号改善BMEC损伤

OGD/R抑AMPK磷酸化，天麻素回抬p-AMPK，CMV-PRMT1阻断该激活。联合AMPK抑制剂dorsomorphin后，天麻素对p-AMPK、ZO-1、Occludin、GPX4的上调被取消（PRMT1不受影响），且活力、抗氧化、线粒体形态、成管、迁移、TEER与通透恢复均丧失，证明PRMT1→AMPK轴必要。

3.6 天麻素在脑微血管组织激活AMPK改善tMCAO小鼠神经功能

tMCAO后Bederson评分升高、转棒落棒缩短、爬杆延时延长；天麻素50–200 mg/kg浓度依赖改善，200 mg/kg与依达拉奉相当，AAV-br1-PRMT1削弱之。TTC示天麻素缩梗死体积，AAV-PRMT1拮抗。微血管WB示天麻素抑PRMT1促p-AMPK，依达拉奉不抑PRMT1但升p-AMPK，AAV-PRMT1升PRMT1阻p-AMPK。

3.7 天麻素以PRMT1依赖方式改善tMCAO小鼠微血管铁死亡与BBB损伤

术后14天梗死同侧微血管ROS、MDA升而GSH、SOD降，GPX4/ZO-1/Occludin降，CD31⁺血管密度减，Evans蓝外渗增；天麻素与依达拉奉复之，AAV-br1-PRMT1削弱天麻素效应，印证体内PRMT1依赖性。

讨论部分总结

讨论指出本研究确立PRMT1为天麻素在CIRI后BBB损伤中的关键调控节点：OGD/R升PRMT1，天麻素促其蛋白不稳定降解，释放对AMPK的抑制，激活AMPK信号并抑BMEC铁死亡，从而护BBB与神经功能。该机制与前人报道天麻素在心肌、阿尔茨海默模型及海马神经元中抗氧化、促血管生成、上调紧密连接相呼应，亦与PRMT1敲低在肿瘤与心梗模型改善存活、白色脂肪PRMT1耗竭激活AMPK脂自噬、以及多则中药/方剂经AMPK缓CIRI的证据链一致。作者自陈局限有二：未阐明天麻素促PRMT1降解属泛素-蛋白酶体抑或自噬-溶酶体途径；AAV-br1在体内表达时序取术前7天而非文献常见14天，可能使缺血起始时PRMT1过表达未达峰值，解释需谨慎。

结论部分翻译

综上，本研究提示天麻素可在CIRI后保全BBB完整性并改善神经功能；研究显示PRMT1/AMPK依赖性铁死亡抑制是天麻素的重要作用机制。