泌尿道共生菌Peptoniphilus spp.编码一种新型17β-羟基类固醇脱氢酶

《Applied and Environmental Microbiology》：The urinary tract commensal Peptoniphilus spp. encodes a novel 17β-hydroxysteroid dehydrogenase

　　

摘要翻译：
泌尿道共生菌Peptoniphilus spp.编码一种新型17β-羟基类固醇脱氢酶
摘要：微生物类固醇代谢代表了脊椎动物内分泌系统一个未被充分认识的延伸，越来越多的证据表明宿主相关微生物有助于人类组织中性类固醇的多样性和生物利用度。新兴研究将微生物雄激素代谢与泌尿道微生物组组成及前列腺癌中雄激素剥夺疗法（ADT）的耐药性联系起来。虽然已报道了能够通过类固醇-17,20-裂解酶途径将皮质醇等类固醇前体转化为雄激素的微生物途径，例如DesG介导的雄烯二酮与睾酮之间的互变，但介导下游雄激素互变的酶多样性仍未完全明确。在此，研究人员调查了男性泌尿生殖道微生物组中厌氧菌的雄激素形成能力，重点关注依赖NADPH的17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSDHs），这些酶催化雄烯二酮和睾酮的互变。研究人员从人类男性尿液中分离出形成雄激素的细菌菌株，并在Peptoniphilus obesi中鉴定出一种此前未表征的17β-HSDH，证明该酶催化NADPH依赖性雄烯二酮还原为睾酮及反向氧化反应。序列相似性搜索进一步在Anaerococcus中鉴定出一种类似的17β-HSDH，该酶被合成并功能验证，尽管与来自Propionimicrobium lymphophilum的先前表征的泌尿道酶DesG序列同一性低，但显示保守活性。这些酶被发现对C19和C18 17-酮和17β-羟基类固醇具有广泛的底物特异性。总之，这些发现扩展了微生物17β-HSDHs的已知多样性，并识别了泌尿生殖道微生物组中先前未识别的雄激素形成活性。

论文解读文章：

**研究背景与问题**
微生物类固醇代谢被视为脊椎动物内分泌系统的一个重要延伸，其通过影响宿主相关微生物的代谢活动，调节性类固醇的多样性和生物利用度。近年研究表明，宿主微生物群（特别是肠道和泌尿道微生物）可能通过类固醇转化途径参与激素相关疾病的发生和发展。其中，雄激素代谢与前列腺癌的关系尤为引人关注。前列腺癌是一种激素敏感性肿瘤，其标准治疗方式为雄激素剥夺疗法（ADT），但部分患者会发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。已有研究提示，肠道微生物通过类固醇转化（如将孕烯醇酮转化为睾酮）可能促进CRPC的进展，但具体酶学机制尚不明确。此外，泌尿道微生物组（包括Peptoniphilus和Anaerococcus等属）与前列腺癌的关联已被反复报道，但这些微生物是否具备雄激素形成能力及其酶学基础此前未被系统研究。因此，本研究的核心问题在于鉴定泌尿道厌氧菌中新型17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSDHs），并阐明其催化雄烯二酮（AD）与睾酮（T）互变的分子机制，从而扩展对微生物雄激素代谢多样性的认识，并为激素驱动疾病提供潜在干预靶点。

**研究内容与结论**
研究人员从人类男性尿液中分离出两株具有17β-HSDH活性的细菌——Peptoniphilus obesi CFH08和Peptoniphilus genitalis CFH36，并通过全基因组测序和功能验证，鉴定出P. obesi中编码新型17β-HSDH的基因CKIMDCCC_00407（重组蛋白rCKIMDCCC_00407）。该酶依赖NADPH，能双向催化AD与T的互变。进一步通过序列相似性搜索，在Anaerococcus sp. Marseille-P9784中鉴定出同源蛋白GAN53_RS08700（重组蛋白rGAN53_RS08700），并验证其具有相同活性，尽管两者与先前表征的泌尿道酶DesG序列同一性低（P. obesi酶与DesG仅42%同一性）。系统发育分析显示，此类17β-HSDH在厌氧菌中广泛分布，包括Peptoniphilus、Anaerococcus、Clostridium等属。酶学特性研究表明，两种酶对C19和C18类固醇（包括11-氧合雄激素、雌激素等）具有广泛底物特异性，但底物偏好存在差异。该研究首次证实Peptoniphilus和Anaerococcus（均与前列腺癌相关）具备雄激素形成能力，扩展了微生物17β-HSDHs的多样性，并提示泌尿道微生物组可能通过局部雄激素合成影响激素驱动疾病。

**主要技术方法**
研究人员采用了以下关键技术：（1）厌氧培养与底物筛选：从男性尿液（样本来源于前列腺活检受试者及年龄匹配对照，年龄>50岁）中分离细菌，并在含11-脱氧皮质醇和11β-羟基雄烯二酮（11OHAD）的PYG培养基中筛选类固醇转化活性；（2）全基因组测序与组装：使用PacBio Revio平台进行长读长测序，通过Flye v2.9和Prokka v1.14.6进行组装和注释；（3）重组蛋白表达与纯化：将目标基因合成并克隆至pET载体，在E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL中表达，通过Strep-tag或His-tag亲和纯化获得纯酶；（4）酶活性测定：采用分光光度法（监测NADPH在340 nm吸收变化）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证产物；（5）动力学与底物特异性分析：测定Michaelis-Menten常数（rCKIMDCCC_00407）或Hill方程参数（rGAN53_RS08700），并评估多种类固醇底物；（6）系统发育分析：基于BLAST搜索和最大似然法构建进化树。

**研究结果**
*分离与鉴定：*
从尿液中分离出P. obesi CFH08和P. genitalis CFH36，经LC-MS确认两者均能将11OHAD还原为11OHT，但无C21侧链裂解活性（不转化11-脱氧皮质醇），表明其特异性表达17β-HSDH活性。P. obesi CFH08基因组大小为1,941,268 bp，GC含量30.44%，包含1,850个预测开放阅读框。

*新型17β-HSDH的鉴定：*
通过基因组注释发现基因CKIMDCCC_00407，编码一个27.1 kDa的SDR家族蛋白（推测为3β-羟基胆酸脱氢酶）。该蛋白与DesG仅有42%氨基酸同一性，但经纯化和功能验证，rCKIMDCCC_00407能催化NADPH依赖性AD还原为T，以及NADP+依赖性T氧化为AD，证明其双向17β-HSDH功能。

*酶动力学与底物特异性：*
rCKIMDCCC_00407在氧化方向最适pH为8.0–9.0（pH 9.0最高），还原方向最适pH为7.5。动力学参数：氧化方向Vmax=77.7 ± 22.5 nmol min^?1 mg^?1，KM=39.6 ± 3.8 μM，kcat=104.5 ± 3.1 s^?1；还原方向Vmax=56.0 ± 5.1 nmol min^?1 mg^?1，KM=14.4 ± 1.2 μM，kcat=75.9 ± 0.9 s^?1。底物特异性显示，还原方向偏好11-酮基雄烯二酮（11KAD）和δ1-雄烯二酮（1,4-11KAD），氧化方向偏好睾酮（T）和双氢睾酮（DHT）。

*Anaerococcus同源酶的表征：*
从Anaerococcus sp. Marseille-P9784中鉴定出GAN53_RS08700（与rCKIMDCCC_00407有86%同一性）。rGAN53_RS08700在还原方向最适pH为6.0，氧化方向最适pH为10.0。动力学呈S形曲线，符合Hill方程（还原方向K0.5=23.3 ± 0.5 μM，Hill系数=4.65 ± 0.49；氧化方向K0.5=27.4 ± 0.5 μM，Hill系数=3.2 ± 0.3），提示正协同性。底物特异性表明其更偏好11-氧合类固醇（如11OHT和11KT），且对雌激素（E1和E2）的活性高于rCKIMDCCC_00407。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Peptoniphilus和Anaerococcus属与前列腺癌的关联已被多项研究报道，但此前未发现其类固醇代谢功能。本研究发现这两种细菌编码功能性的17β-HSDH，能催化AD与T的互变，从而可能通过局部雄激素生成影响前列腺微环境中的激素信号通路。此外，与宿主酶AKR1C3（HSD17B5）类似，P. obesi的17β-HSDH对11KAD有较高亲和力，而11KAD是皮质酮经微生物裂解的主要产物，这可能与前列腺癌进展相关。研究人员强调，尽管本研究未直接证明微生物雄激素生成与前列腺癌的因果关系，但鉴定的酶为潜在治疗靶点或生物标志物提供了基础。结论部分翻译：本研究表明，泌尿生殖道微生物组中的共生厌氧菌（如Peptoniphilus和Anaerococcus）通过编码新型17β-HSDHs，具备雄激素形成能力，从而扩展了微生物类固醇代谢的酶学多样性。这些发现为理解微生物如何通过激素转化影响宿主健康（尤其是激素驱动疾病）提供了新的机制见解，并提示未来研究应结合体内脱共轭（如β-葡萄糖醛酸酶或硫酸酯酶）步骤，全面评估微生物对雄激素池的贡献。论文发表于《Applied and Environmental Microbiology》。