PilI与ChpC在铜绿假单胞菌Chp化学感受阵列结构中的不同作用

《Applied and Environmental Microbiology》：Distinct roles of PilI and ChpC in Pseudomonas aeruginosa Chp chemosensory array architecture

　　

细菌通过化学感受系统整合环境信号，以协调趋化行为并做出生活方式决策，如表面附着和生物被膜形成。核心感受复合体由三个必需组分构成：化学受体、组氨酸激酶和适配蛋白。这些蛋白质共同形成延伸的阵列，从而实现高效的信号转导。铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）的Chp化学感受系统调控两个输出：直接驱动IV型菌毛（type IV pili，T4P）产生蹭行运动（twitching motility），以及调节环磷酸腺苷（cyclic-AMP，cAMP）的产生，后者调控菌毛生物合成和急性毒力。功能完整的Chp化学感受系统需要两个适配蛋白PilI和ChpC。本研究探讨了这些适配蛋白在化学感受阵列组织中的不同贡献。通过细菌双杂交和荧光显微镜技术，研究人员表明PilI与组氨酸激酶相互作用，且对极性信号阵列的形成至关重要。相比之下，ChpC未能显示与组氨酸激酶的直接相互作用，且ChpC的缺失减少了可检测到的Chp信号阵列数量。生物信息学和AlphaFold建模支持阵列内不同相互作用的观点。研究人员将这些结果与先前发表的关于适配蛋白在信号转导中作用的数据相结合，提出了一个扩展阵列结构的模型，其中PilI作为主要适配蛋白，而ChpC的掺入似乎增强了阵列组织和信号传导效率。

**论文解读：铜绿假单胞菌Chp化学感受系统中PilI与ChpC的结构与功能分化**

**一、研究背景与科学问题**

细菌依赖化学感受系统（chemosensory systems）感知胞外环境信号，并协调趋化、表面附着及生物被膜形成等生活方式决策。核心感受复合体由三类蛋白质组成：形成三聚体二聚体（trimers of dimers）的化学受体（chemoreceptors）、组氨酸激酶（histidine kinase，CheA）二聚体，以及作为支架蛋白的适配蛋白（adaptor proteins，CheW）。这些核心复合体通过高阶相互作用组装成具有六方或正交对称性的大型有序阵列，从而实现高灵敏度、协同性和信号放大功能。在经典的模式生物大肠杆菌（*Escherichia coli*）中，阵列基板由CheW与CheA交替组成的六元环或六个CheW单体构成，CheA二聚体作为"结构钉"连接相邻六元环，提供阵列的结构稳定性。

与大肠杆菌等Fla（鞭毛运动）类系统通常仅使用单一适配蛋白不同，F6、F10、IV型菌毛（Tfp）及替代性（非运动）细胞功能（ACF）类化学感受系统的保守基因组织表明其利用多个适配蛋白。铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）拥有四套完整的化学感受系统，其中Chp系统属于Tfp类，编码两个适配蛋白PilI和ChpC。Chp系统通过化学受体PilJ接收信号，经组氨酸激酶ChpA传递磷酸基团至响应调控蛋白PilG和PilH，最终调控两个输出：直接驱动IV型菌毛介导的蹭行运动，以及通过调节腺苷酸环化酶CyaB活性控制cAMP产生，后者进而调控菌毛生物合成和急性毒力。

前期在铜绿假单胞菌PAK菌株中的研究表明，PilI和ChpC功能不等效：PilI缺失导致通过CyaB产生的cAMP完全消失，细胞丧失蹭行运动能力；而ChpC缺失仅产生部分表型。然而，这两个适配蛋白在Chp阵列结构中的具体作用及其对信号转导的影响尚不清楚。理解PilI和ChpC的作用对于认识多适配蛋白化学感受系统的组织结构以及铜绿假单胞菌的调控和毒力机制具有重要意义。本研究旨在明确PilI和ChpC在组织Chp化学感受阵列中的角色，并提出Chp阵列形成的模型及其对下游信号传导的影响。

**二、主要技术方法概述**

研究人员运用多种关键技术手段开展研究：（1）利用MiST数据库和系统发育分析，调查了γ-变形菌纲中Tfp类化学感受系统的分布及适配蛋白编码数量；（2）采用细菌腺苷酸环化酶双杂交（BACTH）系统检测Chp信号阵列核心组分间的蛋白质-蛋白质相互作用；（3）运用荧光显微镜和demograph分析观察PilJ-mCherry融合蛋白在野生型及突变株中的亚细胞定位模式；（4）通过AlphaFold蛋白质结构预测和NCBI保守结构域数据库分析适配蛋白与ChpA P5结构域的潜在相互作用；（5）采用β-半乳糖苷酶报告基因系统测定胞内cAMP相对水平，通过蹭行运动平板实验评估运动能力，并利用Western blot和SDS-PAGE分析全细胞及表面PilA蛋白水平。研究使用的菌株为铜绿假单胞菌PAO1（Iglewski strain），所有表型实验均基于该菌株及其衍生突变株。

**三、研究结果**

**（一）Tfp类系统在γ-变形菌中的系统发育分布**

研究人员将Williams等人构建的γ-变形菌系统发育树与MiST数据库交叉比对，鉴定含有Tfp类化学感受系统的物种及其编码的CheW样适配蛋白数量。结果显示Tfp类系统聚集在两个不同的进化枝（"PO"和"Basal"）中，约77%的已鉴定系统编码两个适配蛋白。对β-变形菌的进一步调查发现，其Tfp类系统几乎仅含单一适配蛋白，与γ-变形菌形成鲜明对比。这一分布差异凸显了多适配蛋白系统在特定细菌类群中的普遍性和进化意义。

**（二）序列分析与结构预测**

PilI与ChpC蛋白序列配对比对显示20.28%的一致性，而与大肠杆菌CheW的一致性分别为21.57%和22.08%。NCBI保守结构域数据库分析表明，PilI含有指示推定CheA相互作用表面的保守残基，而ChpC则缺乏该特征。AlphaFold预测的PilI与ChpA P5结构域复合物模型具有较高的整体置信度（pTM评分），而ChpC-ChpA模型的pTM评分仅略高于0.5阈值，其ipTM评分引入了对ChpA预测结构的不确定性。PilI-ChpA界面的局部置信度（pLDDT）较高，表明该模型在这些区域较为可靠。计算预测虽未对PilI与ChpA的相互作用给出确定性结论，但对ChpC与ChpA P5结构域的相互作用提出了重要质疑。

**（三）核心信号阵列组分间的相互作用**

BACTH实验表明，PilI和ChpC彼此相互作用，但均不显示自相互作用。截短的ChpA（ChpA^CheA，编码氨基酸1668-2349，包含磷酸转移结构域、ATPase结构域、P5结构域和二聚化结构域）与PilI相互作用，但不与ChpC相互作用，这与NCBI-CDD数据库的计算机预测结果一致。研究人员未能检测到适配蛋白与PilJ之间的相互作用，推测是由于PilJ的三聚体关联结构域延伸至细胞质中超过28 nm，BACTH系统的T18和T25片段无法在该距离下接近。PilJ显示强烈的自相互作用，证实其形成同源二聚体。

**（四）PilJ极性定位依赖于PilI而非ChpC**

荧光显微镜观察显示，在野生型细胞中PilJ-mCherry定位于细胞两极。pilI缺失导致PilJ-mCherry焦点消失，整个细胞长度范围内背景荧光增强。在chpC缺失株中，与野生型相比仅小部分细胞保留极性PilJ-mCherry焦点。这些数据表明ChpC不是阵列结构的必需组分，而PilI对化学感受阵列的形成至关重要。

**（五）适配蛋白的功能作用**

**PilI是Chp信号转导所必需的：** ΔpilI菌株胞内cAMP水平显著降低（P = 0.013），与ΔcyaB阴性对照相当（P = 0.181）；蹭行运动也显著下降（P = 1.14e-14），与ΔpilA阴性对照相似（P = 0.346）。pilI互补将cAMP和蹭行运动恢复至野生型的约50%，可能归因于非天然启动子表达导致的化学计量失衡或N端6X-His标签的干扰。在ΔpilI中表达ChpC不能互补PilI功能，进一步证明两者功能不等效。

**ChpC并非Chp信号转导所必需：** ΔchpC菌株显示胞内cAMP水平降至野生型的约48%（P = 0.031），蹭行运动降至约46%（P = 1.30e-13）。chpC互补可将cAMP恢复至野生型水平并部分恢复蹭行运动。在ΔchpC中反式表达pilI显示cAMP水平略有但不显著的升高，提示pilI过表达可能部分补偿ChpC缺失。

**过量cAMP恢复ΔchpC的蹭行运动：** 表达组成型活性CyaB突变体（CyaB^R412H）在ΔchpC和ΔcyaB中产生至少为野生型两倍的cAMP水平，并将蹭行运动恢复至野生型水平（P = 0.500），证明当cAMP充足时ChpC对支持蹭行运动的信号转导并非必需。而在ΔpilI和新型双缺失株ΔpilIΔchpC中，即使cAMP升高，蹭行运动仍不能恢复至野生型水平（P < 0.0001），突显PilI在阵列形成和运动中的核心作用。cAMP恢复已知可增强T4P生物合成和运动基因（pilB和pilT/U）的表达，残余运动活性可能源于非Chp信号的背景活动。

**四、讨论与结论**

基于上述实验结果，研究人员提出了铜绿假单胞菌Chp化学感受阵列的结构模型。该模型以细菌和古菌中保守的P6六方基板模式为基础，每个六元环由三个PilI单体与ChpA^P5和/或ChpC组合间隔排列。预测PilI:ChpA^P5:ChpC比例为3:1:2的六元环对ChpA信号转导最有效，可将五个PilJ受体的信号整合至单个ChpA；但3:3:0、3:2:1、3:1:2和3:0:3等比例可能共存于同一阵列中。各类型六元环的可互换性赋予阵列动态性、敏感性、结构灵活性和稳定性。

在ΔpilI菌株中，由于ChpC不显示自相互作用或与ChpA的相互作用，预测无稳定的化学感受复合体形成，与荧光显微镜观察到的PilJ焦点消失以及cAMP产生和蹭行运动缺失的表型一致。在ΔchpC菌株中，阵列形成仍可发生，但仅能形成PilI:ChpA^P5:ChpC比例为3:3:0的六元环，意味着每个ChpA仅能整合两个PilJ受体，预期阵列更小、效率和灵敏度更低、结构灵活性更差，与观察到的cAMP和蹭行运动降低相符。在cAMP充足条件下，ΔchpC形成的小阵列足以支持野生型水平的蹭行运动，这与机械感受模型一致：活跃蹭行的细胞处于高信号环境。

该模型同时符合机械感受和化学感受信号转导模型：PilJ接收机械或化学信号，通过PilI直接或经ChpC和PilI串联传递至ChpA，触发ChpA自磷酸化；ChpA-P磷酸化PilG，使其定位于蹭行细胞前极；PilG-P还调节CyaB活性产生cAMP，cAMP结合Vfr后诱导菌毛组装、排列和运动基因表达。该模型为信号从PilJ经信号阵列转导至ChpA的途径提供了特异性。

研究人员讨论了ChpC可能整合第二个未鉴定的化学受体进入Chp阵列的可能性。虽然BACTH实验未能检测到ChpC与截短ChpA的相互作用，且PilI和ChpC彼此相互作用而非自相互作用，但基于ΔchpC中观察到的多重表型缺陷，ChpC与PilJ可能作为更大阵列的一部分相互作用。然而，BACTH方法不足以就PilJ与任何基板组分的相互作用得出结论，且PilJ与ChpC的相互作用并不排除ChpC与另一化学受体相互作用的可能性。基于计算分析，铜绿假单胞菌基因组中仅PilJ被分配至Chp系统，所有其他40H七残基重复类化学受体均分配至CheI或Wsp系统。若后续实验证明ChpC整合第二个化学受体进入Chp系统，本研究模型仅需少量修正即可纳入第二受体，无需改变六元环基板模型，ChpC仍作为辅助组分。

**研究结论：** 本研究表明PilI是Chp系统中的主要适配蛋白，在阵列形成中发挥必需作用，且是唯一直接与组氨酸激酶ChpA接口的适配蛋白。虽然两个适配蛋白均为Chp系统完全功能所必需，但当cAMP独立于Chp信号转导提供时，不完整阵列（ΔchpC）即可实现野生型水平的蹭行运动。这些结果共同构建了与每个适配蛋白相互作用组和定位研究一致的Chp阵列形成模型。该研究为理解多适配蛋白化学感受系统的组织结构以及阵列结构如何影响信号整合提供了框架，揭示了核心信号组分变异如何塑造细菌对环境条件的响应。研究成果发表于《Applied and Environmental Microbiology》。