木材腐朽真菌裂褶菌中由酶催化与Fenton反应介导的双重产甲烷机制

《Applied and Environmental Microbiology》：A dual methane production mechanism mediated by enzymatic catalysis and the Fenton reaction in the wood-rotting fungus Schizophyllum commune

　　

理解生物甲烷源对于阐明全球甲烷循环和应对气候变化至关重要。传统研究主要聚焦于原核产甲烷菌，但新兴证据表明真核生物，特别是真菌，能够通过酶促和非酶促两种途径产生甲烷。然而，迄今尚无真核生物被记录同时拥有这两条途径的报道。本研究提供了初步证据，表明从海底以下约2 km深的沉积物中分离的木材腐朽真菌裂褶菌（*Schizophyllum commune*）菌株20R-7-F01采用双重机制产生甲烷。通过在铁充足（50 μM Fe³⁺，以促进Fenton反应）和无铁条件下比较野生型（WT）菌株与*mct1*（甲基氯转移酶1，methyl chloride transferase 1）和*dh3*（脱卤酶3，dehalogenase 3）缺陷型菌株，研究人员估算酶促途径约占总甲烷产量的82%–85%。其余约15%–18%的甲烷产出与Fenton型化学反应的贡献一致，该途径贡献的定量划分来源于跨条件产量比较。氧、温度和底物类型等环境因素显著影响酶促效率，而非酶促途径的效能取决于甲基供体浓度，特别是二甲基亚砜（DMSO）。此外，两条途径均被过氧化氢（H₂O₂）激活，表明活性氧（ROS）对甲烷合成具有正向调控作用。本研究揭示了真菌产甲烷中一种新型共存的"酶促-Fenton"机制，突显了真菌在全球甲烷收支和碳循环中的关键作用。

甲烷（CH₄）是一种强效温室气体，其全球变暖潜力远超二氧化碳（CO₂），是气候变化的关键驱动力。理解甲烷的生物来源对于制定有效的减缓策略至关重要。传统上，生物产甲烷研究主要聚焦于原核产甲烷菌。然而，近年来积累的证据表明，真菌也能通过两种机制上截然不同的途径产生甲烷：一是涉及甲基转移酶和脱卤酶的酶介导途径；二是由活性氧（ROS）驱动的非酶促Fenton反应，其中亚铁离子（Fe²⁺）与ROS反应，在有氧条件下释放甲烷。裂褶菌（*Schizophyllum commune*）是一种木材腐朽担子菌，其基因组注释揭示了两个甲基转移酶基因（*mct1*和*mct2*）和五个脱卤酶基因（*dh1*–*dh5*）。前期研究表明，*mct1*和*dh3*在该菌厌氧产甲烷途径中发挥核心作用。尽管已有这些进展，但尚无研究在实验上证实单一真核生物能够同时运行酶介导和基于Fenton的甲烷生产途径，环境变量对这两条途径活性及其相对贡献的影响也未得到充分阐明。针对上述问题，研究人员以从海底以下约2 km深沉积物中分离的裂褶菌菌株20R-7-F01为模型生物，通过构建*mct1*和*dh3*基因敲除突变体并在不同Fe³⁺、温度和底物条件下与野生型（WT）比较甲烷产量，证明了该菌株同时具备酶促和Fenton介导的双重产甲烷途径。研究结论指出，这一发现在任何真核生物中均属首次报道，挑战了以原核生物为中心的产甲烷观，为理解富氧和富铁环境中的甲烷循环开辟了新途径，对气候模型和碳循环研究具有重要意义。该论文发表于《Applied and Environmental Microbiology》。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR-Cas9系统构建了*mct1*单敲除突变体（Δ*mct1*）、*dh3*单敲除突变体（Δ*dh3*）和双敲除突变体（Δ*mct1-dh3*），以及相应的回补菌株（Δ*mct1*/p*mct1*和Δ*dh3*/p*dh3*）；通过基因组PCR和Sanger测序验证基因敲除，利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测残余转录水平；使用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）定量顶空气体中甲烷浓度；采用DCFH-DA荧光法检测胞内ROS水平；通过配对t检验验证两条途径的加和性；使用方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行多组比较，Pearson相关系数（r）分析ROS水平与甲烷产量之间的相关性。所用菌株样本来源于海底以下约2 km深的沉积物中分离的*S. commune*菌株20R-7-F01。

**裂褶菌甲烷合成中的关键基因**

通过CRISPR-Cas9构建基因敲除菌株并进行功能验证，研究发现所有基因缺失菌株的菌丝生长和形态与WT相当，但甲烷产量在缺失菌株中显著降低：Δ*mct1*产生0.08 nmol/mg，Δ*dh3*产生0.06 nmol/mg，Δ*mct1-dh3*未检测到甲烷，而WT产生0.67 nmol/mg。回补菌株Δ*mct1*/p*mct1*和Δ*dh3*/p*dh3*恢复了接近WT水平的甲烷产量（分别为0.61和0.65 nmol/mg）。这表明*mct1*和*dh3*是甲烷合成途径中的关键催化基因，且其他家族成员可能存在部分功能补偿。形态与功能的解耦清楚地表明，甲基转移酶（mct）和脱卤酶（dh）基因是代谢特异性基因，而非菌丝基础生长所必需。

***S. commune*中酶促与铁依赖性非酶促甲烷生产途径的共存**

通过在无铁和50 μM Fe³⁺条件下比较WT和Δ*mct1-dh3*菌株的甲烷产量，研究证实该菌株依赖酶促和非酶促两条途径产生甲烷。在无铁条件下，WT菌株甲烷产量随培养时间增加（1天0.55、3天0.67、5天0.89 nmol/mg），而Δ*mct1-dh3*菌株在整个培养期间未检测到甲烷，证实酶促途径完全独立于外源铁。在铁充足条件下，WT和Δ*mct1-dh3*菌株甲烷产量均显著提高，表明存在与Fenton型氧化还原化学一致的铁相关甲烷生成途径。Δ*mct1-dh3*菌株在富铁培养基中甲烷产量随时间保持稳定，平均为0.14 nmol/mg。配对t检验证实两条途径间无显著的协同或抑制作用。基于加和性验证，约82%–85%的甲烷来自酶促*mct*/*dh*途径，其余15%–18%来自铁依赖性Fenton型过程。研究人员指出，该估算基于途径产量的加和性观察，而非Fenton反应活性的直接验证（如羟基自由基检测或特异性抑制剂实验），应作为观察性估算而非途径贡献的最终归因。

**环境因素对*S. commune*酶促和非酶促途径甲烷生产的影响**

氧暴露对两条产甲烷途径产生相反的调控效应。在30°C好氧条件下（21% O₂），酶促途径甲烷产量为0.33 nmol/mg，铁依赖非酶促途径为0.39 nmol/mg；在厌氧条件下，酶促途径增至0.67 nmol/mg，非酶促途径降至0.19 nmol/mg。两条途径在好氧和厌氧条件下均保持活性，氧抑制酶促途径约51%，同时激活非酶促Fenton途径约105%。这种氧诱导的差异性调控部分补偿了酶促途径的抑制，使生物体即使在酶促途径被抑制的好氧条件下仍能维持相当比例的产甲烷能力。

温度方面，40°C时酶促途径产量降至0.52 nmol/mg（较30°C降低22.4%），非酶促途径产量保持0.18 nmol/mg稳定，表明酶促过程更易受热应激影响，*mct*和*dh*在高温下可能被抑制。底物类型对甲烷产量影响显著，碳水化合物（葡萄糖、半乳糖）产量最高，芳香族底物（如2-甲氧基苯甲酸、苯酚）产量显著降低；DMSO作为唯一碳源时，酶促途径完全被抑制，Fenton型途径产量降至0.06 nmol/mg，这可能是由于DMSO不支持核心代谢过程并阻碍蛋氨酸合成。此外，1.5 mM H₂O₂处理使酶促途径甲烷产量增至1.65 nmol/mg（约为对照组的2.5倍），Fenton途径产量增至0.44 nmol/mg，贡献比例保持约80%酶促和20% Fenton的稳定比率，表明H₂O₂在不破坏两条途径间平衡的情况下刺激了甲烷生产的代谢通量。

**ROS在*S. commune*产甲烷中的作用**

研究表明H₂O₂暴露与酶促和非酶促两条途径的甲烷产量增强显著相关。随着H₂O₂浓度增加（0.75、1.5、3 mM），WT和Δ*mct1-dh3*菌株的ROS水平呈剂量依赖性增加。WT菌株ROS水平分别为2.85、5.9和10.85 AU g^-1，Δ*mct1-dh3*菌株则更高，分别为7.54、11.29和17.57 AU g^-1。胞内ROS水平与总甲烷产量（r = 0.96）、酶促途径甲烷产量（r = 0.88）和非酶促途径甲烷产量（r = 0.92）之间均存在强正相关。在1.5 mM H₂O₂处理下，WT菌株的甲烷增量（0.194 nmol/mg per AU/g ROS）显著高于Δ*mct1-dh3*菌株（0.0264 nmol/mg per AU/g ROS），表明酶促产甲烷途径与ROS水平的关联性强于以Fenton途径为主的突变体。研究人员指出，本研究中DCFH-DA法反映的是总胞内氧化活性，而非特异性检测Fenton化学产生的羟基自由基（·OH）；本研究仅提供了ROS水平与甲烷产量的相关性证据，未在本实验体系内进行ROS清除剂干预实验以直接验证ROS作为介导因子的必要性，但前期研究中ROS清除剂丁基羟基甲苯（BHT）显著抑制了产甲烷，间接支持了ROS的因果作用。

**结论**

本研究证明*S. commune*菌株20R-7-F01具有双重产甲烷途径：依赖*mct1*和*dh3*的酶促途径以及非酶促Fenton型反应。这两种机制在一种真核真菌中的共存突显了该生物的代谢多能性，将人类对生物产甲烷的理解拓展至经典古菌域之外。研究结果进一步揭示，环境因素特别是氧和氧化应激对两条途径的相对贡献产生差异性影响，表明ROS可能作为连接环境条件与真菌产甲烷代谢调节的关键节点。然而，ROS调控的具体分子机制仍有待进一步阐明。该研究将*S. commune*定位为研究氧化应激下甲烷生产调控机制的有价值模型生物，为理解实验框架内的生物产甲烷提供了新的见解。虽然将研究结果外推至更广泛的环境背景需要谨慎，但这些发现可能为评估真菌在相关氧化条件下甲烷循环中的潜在作用提供初步启示。未来研究应聚焦于阐明ROS影响甲烷生产的分子途径，为评估其在自然生态系统中的潜在意义提供更坚实的基础。