具有协同放大效应的Cu2O@CeO2异质结构纳米酶增强免疫分析用于食品中沙门氏菌的灵敏检测

《Current Research in Food Science》：Cu 2O@CeO 2 heterostructure nanozyme with synergistic amplification effect-enhanced immunoassay for sensitive detection of Salmonella in food

　　

基于纳米酶标记的比色免疫分析为快速检测致病菌以确保食品安全提供了有前景的解决方案。然而，纳米酶缓慢的电子转移动力学和有限的活性位点导致其催化活性不理想，实现灵敏检测仍是一个挑战。在此，研究人员报道了一种具有协同放大效应的Cu₂O@CeO₂异质结构纳米酶，该纳米酶整合了快速电荷转移动力学和丰富活性位点，以增强比色免疫分析，实现对致病菌的灵敏检测。高活性的CeO₂纳米颗粒（NPs）被均匀且牢固地锚定在稳定的Cu₂O纳米立方体上，形成Cu₂O@CeO₂核壳异质结构，这有效缓解了NPs的聚集，并实现了催化活性位点的极度暴露。密度泛函理论（DFT）计算表明，异质界面处的电子转移诱导了强内建电场，同时具有丰富的密度和对H₂O₂的高亲和力，从而增强了纳米酶的反应动力学和催化活性。得益于这些优势，Cu₂O@CeO₂异质结构纳米酶表现出优异的类过氧化物酶活性，能够有效催化底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）生成蓝色氧化TMB。更重要的是，利用Cu₂O@CeO₂纳米酶作为标记探针的比色免疫分析实现了对沙门氏菌的灵敏检测，检测限（LOD）低至26 CFU/mL，并在加标食品样品中表现出高特异性和稳定的适用性。这项工作为开发高活性异质结构纳米酶以及推进快速细菌检测技术的发展以确保食品安全提供了科学见解。

食源性疾病是日益严重的全球公共卫生问题，对经济和社会造成重大影响。世界卫生组织将沙门氏菌等致病菌列为食源性疾病的主要病原。传统培养法虽为金标准，但耗时2-4天；聚合酶链式反应（PCR）虽快，但依赖复杂操作和专业设备。比色免疫分析具有操作简便、肉眼判读等优势，但基于天然酶如辣根过氧化物酶（HRP）标记的比色免疫分析灵敏度不足，原因在于天然酶活性易受环境因素影响。纳米酶作为具有类酶活性的纳米材料，因其催化活性可调、稳定性高和成本低而受到关注。其中，CeO₂纳米颗粒具有氧空位和Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原对，但易团聚导致活性下降。为克服这一瓶颈，研究人员以Cu₂O纳米立方体为支架，构建Cu₂O@CeO₂核壳异质结构，旨在通过协同放大效应增强催化活性，实现沙门氏菌的灵敏检测。该研究成果发表于《Current Research in Food Science》。

研究人员采用模板辅助法合成Cu₂O@CeO₂异质结构纳米酶，并将其与抗沙门氏菌单克隆抗体结合作为信号探针，同时将多克隆抗体修饰到羧基化磁珠上作为捕获探针，形成夹心免疫复合物。通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）等对材料进行表征。利用密度泛函理论（DFT）计算界面电子转移。在优化条件下对加标鸡肉和牛奶样品进行检测，样本来源于当地超市。

3.1 表征
通过SEM、TEM、高分辨TEM（HRTEM）、XPS等表征证实了核壳结构的成功构建，CeO₂均匀锚定在Cu₂O立方体上，界面清晰，晶格间距分别对应Cu₂O（111）和CeO₂（111）晶面。XPS显示Ce 3d结合能负移0.6 eV，Cu 2p结合能正移0.4 eV，证明电子从Cu₂O转移到CeO₂，形成强界面电子相互作用。O 1s光谱表明Cu₂O@CeO₂的氧空位/晶格氧比例高达2.35，高于纯CeO₂（1.91）和Cu₂O（0.12）。抗体修饰后，DLS和Zeta电位变化证实抗体成功连接，BCA蛋白测定确定抗体负载量为38.99 μg/mL（对于0.5 mg/mL纳米酶）。

3.2 催化性能
以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）为底物验证了Cu₂O@CeO₂的类过氧化物酶活性，最佳条件为pH 4、40℃和10 min。稳态动力学分析表明，Cu₂O@CeO₂对TMB和H₂O₂的米氏常数（K_m）低于HRP、纯Cu₂O和CeO₂，最大反应速率（V_max）更高，催化效率显著提升。活性氧（ROS）清除实验和电子自旋共振（ESR）证实催化过程中产生羟基自由基（•OH）为主要活性物种。此外，纳米酶在pH 2-10和10-85℃条件下孵育后催化活性无明显变化，储存一个月后活性保持稳定。

3.3 密度泛函理论分析
DFT计算结果显示，Cu₂O@CeO₂在费米能级附近具有金属性，电荷密度差分析表明CeO₂侧电子积累、Cu₂O侧电子耗尽，由此形成从CeO₂指向Cu₂O的强内建电场（BIEF）。H₂O₂吸附后，Cu₂O@CeO₂的O-O键长最长（1.586 ?），吸附能最强（-1.860 eV），Bader电荷转移量最高（1.301 e^-），表明界面电子转移增强了对H₂O₂的活化和吸附能力，与催化动力学结果一致。

3.4 比色免疫分析性能
所建立的比色免疫分析在4.2×10¹-4.2×10⁵ CFU/mL范围内呈良好线性，检测限（LOD）低至26 CFU/mL。特异性实验表明，即使非目标菌浓度为目标菌的100倍，其信号仍显著低于沙门氏菌。加标鸡肉样品回收率范围为96.72%-113.11%，加标牛奶样品为95.09%-114.07%，批内和批间变异系数（CV）均低于13%，重复性良好。

讨论部分指出，Cu₂O@CeO₂异质结构的协同放大效应源于三方面：Cu₂O核作为稳定支架分散CeO₂并防止其团聚；CeO₂壳保护Cu₂O并维持界面稳定性；界面BIEF加速电子传输并改善反应动力学。同时，丰富的氧空位和界面活性位点增强了对H₂O₂的亲和力，共同赋予纳米酶优异的类过氧化物酶活性和稳定性。

总之，研究人员成功构建了具有协同放大效应的Cu₂O@CeO₂异质结构纳米酶，将快速电荷转移动力学与丰富活性位点整合为信号探针，并开发了增强比色免疫分析，实现了对沙门氏菌的灵敏检测。Cu₂O纳米立方体作为稳定支架支撑并分散CeO₂纳米颗粒，有效提高了活性位点的暴露。同时，CeO₂壳层作为保护屏障，提高了纳米酶的结构稳定性和抗干扰能力。实验研究和催化动力学分析表明，Cu₂O@CeO₂异质结构纳米酶具有优异的类过氧化物酶活性和高稳定性。DFT计算验证了Cu₂O@CeO₂异质界面内存在强BIEF，导致更快的界面电子转移和更高的H₂O₂吸附能力，从而展现出优越的催化性能。更重要的是，以Cu₂O@CeO₂纳米酶为标记探针的比色免疫分析在1小时内实现了对沙门氏菌的灵敏检测，LOD为26 CFU/mL。此外，该比色免疫分析在加标食品样品中表现出高特异性和稳定的检测性能。这项工作为推进异质结构纳米酶在致病菌检测中的应用提供了有前景的途径。