鸟枪法宏基因组学揭示西德克萨斯州美洲黑熊（*Ursus americanus*）食性的季节性变化

《Global Ecology and Conservation》：Shotgun metagenomics reveals seasonal variation in the diet of American black bears ( Ursus americanus) in West Texas

　　

摘要

了解野生动物的食性需求对于阐明营养级相互作用以及为有针对性的保护与管理策略提供信息至关重要，这些策略包括栖息地改善、人与野生动物冲突缓解以及补充投喂项目设计。对野生动物取食行为的直接观察往往具有挑战性；然而，非侵入性采集的粪便样本为重建难以直接观察物种的食性提供了一种有价值的手段。本研究利用对采自西德克萨斯州Trans-Pecos生态区的134份粪便样本进行鸟枪法宏基因组测序，以表征美洲黑熊（*Ursus americanus*）的食性并评估食性组成的季节性变化。食性以植物材料为主（71.0%），动物来源序列占12.7%，另有16.3%未被分类。在α多样性和β多样性指标上均检测到显著的季节性变化。食性丰富度（Hill0）在夏季最高，而食性多样性（Hill1）在春季最高。置换检验分析表明，食性组成在各季节间存在显著差异（Bray–Curtis：R2 = 9.4%，p = 0.013；Jaccard：R2 = 7.2%，p = 0.04）。差异丰度分析揭示了优势类群的明显季节性模式，包括夏季的多刺梨果仙人掌（*Opuntia*）、秋季的橡树（*Quercus*）、春季的麻风树（*Jatropha*）以及冬季的鳞果百合（*Dasylirion*）。研究还检测到与人为食物补贴相关的属，包括马唐（*Digitaria*）、高粱（*Sorghum*）和玉米（*Zea*），表明食性暴露于人类改造的食物资源。这些发现证明了鸟枪法宏基因组学用于非侵入性食性监测的实用性，并为黑熊的季节性资源利用提供了见解，对管理人与熊的互动、优先开展栖息地保护以及在人类改造景观中监测重新定殖种群具有直接意义。

美洲黑熊食性的季节动态：基于鸟枪法宏基因组学的非侵入性解析

美洲黑熊（*Ursus americanus*）作为大型食肉目中典型的杂食性动物，其食性研究对于理解营养级联效应、能量流动及种群动态具有重要生态学意义。历史上，德克萨斯州曾广泛分布着美洲黑熊，但由于19世纪末至20世纪初的栖息地丧失、无节制捕猎以及人类定居扩张，该物种于20世纪中叶在本州功能性灭绝。随着狩猎禁令的实施和物种保护地位的确立，西德克萨斯州Trans-Pecos地区自数十年起经历了黑熊的自然重新定殖过程。这一重新定殖种群面临的是深刻改变后的资源景观，包括原生食物减少、栖息地结构改变以及新的人为食物补贴。因此，解析重新定殖种群在人类主导景观中的食性生态，对于制定有效的保护与管理策略至关重要。

传统食性分析方法，如粪便残留物的形态学鉴定，存在劳动强度大、需专业知识、易受观察者偏差影响等局限，且分类分辨率有限，难以检测高度消化的食物成分。稳定同位素分析和DNA宏条形码技术虽提供了有价值的宏观食性信息，但往往受限于较高分类水平，可能忽略软体、高度消化或低丰度的食物项目。鸟枪法宏基因组测序作为一种免PCR扩增的方法，无需预先了解目标类群，能够从样本中恢复多样化的DNA序列，为食性重建提供了新的技术途径。然而，该方法在自由活动的杂食性哺乳动物食性研究中应用极为有限，此前尚无研究采用此方法表征美洲黑熊的食性。

本研究的通讯作者团队来自德克萨斯理工大学，合作方包括德克萨斯州公园与野生动物部。研究人员于2020年至2024年间在德克萨斯州西部Brewster、Presidio和Terrell县的私人领地（主要位于El Carmen Land and Conservation Company, LLC牧场）非侵入性采集了134份黑熊粪便样本。样本分布于秋季（n = 81）、春季（n = 19）、夏季（n = 27）和冬季（n = 7）四个季节。所有采集点均位于奇瓦瓦沙漠生态区内。

研究人员对样本进行了鸟枪法宏基因组测序，共获得1,209,561,502条原始读段，平均每样本9,026,910条。数据分析流程包括：通过Bowtie2比对至黑熊参考基因组以去除宿主DNA；非宿主读段先比对至包含Trans-Pecos生态区相关动植物基因组的定制参考数据库，未比对上的读段再通过BLASTN搜索NCBI真核生物核苷酸数据库进行分类；剩余读段使用Kraken2比对至PlusPF数据库以评估原核生物比例。为控制重复采样，研究人员利用全基因组测序和靶向SNP panel推断个体身份，基于King-robust亲缘系数鉴定重复样本，将134份样本归为多个个体。个体鉴定结果为后续统计分析中作为随机效应提供了依据。此外还利用LEfSe分析方法识别季节间差异丰度类群。

研究结果显示，黑熊食性以植物材料为主导，占所有分类读段的71.0%，动物来源序列占12.7%，16.3%的读段未能分类到界或主要类群水平。在植物类群中，禾本科（Poaceae）占植物分配读段的约60%，天门冬科（Asparagaceae）约11%，仙人掌科（Cactaceae）约9%。属水平上，马唐（*Digitaria*）是最稳定检出的植物属（33%），其次为高粱（*Sorghum*，16%）、鳞果百合（*Dasylirion*，10%）、玉米（*Zea*，9%）和仙人掌属（*Opuntia*，8%）。动物来源读段中，无脊椎动物占多数，其中蟋蟀科（Gryllidae）约占动物读段的55%；脊椎动物中鼠科（Muridae）约15%，鹿科（Cervidae）约10%。属水平上，田野蟋蟀（*Gryllus*，29%）和家蟋蟀（*Acheta*，21%）最为突出。

物种丰富度稀疏曲线分析表明测序深度足以捕获绝大部分食性多样性，Good's coverage平均估计值为92%。共鉴定出490个属，归属于272个科。ComplexUpset图分析显示，79个属（16.1%）在四个季节中均有检出，构成黑熊食性的核心成分。夏季检出的特有属最多（213个，43.4%），秋季78个（15.9%），春季和冬季分别为2.1%和0.6%。

线性混合效应模型分析表明，季节对食性丰富度（Hill0）有显著影响（F = 4.85，p = 0.003），夏季丰富度最高，冬季最低，秋季与夏季、春季与夏季、夏季与冬季之间存在显著配对差异。食性多样性（Hill1）也随季节显著变化（F = 2.42，p = 0.041），春季多样性最高，秋季与冬季、夏季与春季之间差异显著。PERMANOVA分析显示，季节显著影响食性组成（Jaccard：R2 = 7.2%，p = 0.04；Bray–Curtis：R2 = 9.4%，p = 0.013），且夏季食性组内离散度显著大于其他季节。NMDS排序直观展示了季节间的分离趋势，但各季节样本存在一定程度的重叠。

LEfSe差异丰度分析揭示了各季节的特征性食物类群：夏季以多刺梨果仙人掌（*Opuntia*）、小檗（*Berberis*）、牧豆树（*Prosopis*）、柿属（*Diospyros*）和西貒（*Pecari*）为主导；秋季显著富集栎属（*Quercus*）、刺柏属（*Juniperus*）、松属（*Pinus*）、造纸胡蜂属（*Polistes*）和播娘蒿属（*Descurainia*）；春季以麻风树属（*Jatropha*）和马唐属（*Digitaria*）为特征；冬季则表现为鳞果百合属（*Dasylirion*）、高粱属（*Sorghum*）和丝兰属（*Yucca*）的相对丰度升高。

这项研究在讨论部分指出，以植物为主的食性模式与此前在德克萨斯州和墨西哥北部的研究结果一致，证实了黑熊作为依赖植被并辅以动物性食物的广食性杂食动物的生态定位。禾本科植物的主导地位反映了草本植物在快速生长初期具有较高蛋白质和较低纤维素的营养特征。马唐、高粱和玉米等属的检出可能反映了野生动物补充投喂器和农业资源等人为食物补贴的获取，但研究人员谨慎指出，部分粪便样本采集自活跃的投喂器附近，可能高估了这些类群的相对丰度。相较于Big Bend地区和Coahuila州Burro Mountains山麓的先前研究，本研究中多汁植物（如仙人掌属和鳞果百合属）的消费比例显著更高，可能反映了干旱条件下这些植物在满足能量和水分需求方面的作用。

季节性食性变化模式清晰体现了黑熊的觅食策略弹性：春季依赖高蛋白、低纤维的草本植物以恢复冬眠后的肌肉质量；夏季转向富含碳水化合物的肉质果实以支持高活动期的能量积累；秋季以橡子等坚硬 mast 为主要能量来源；冬季则依赖耐旱多汁植物提供水分和纤维。夏季较高的食性丰富度和组内离散度反映了在炎热干燥条件下，偏好资源有限且斑块化分布，促使黑熊采取更广泛的机会主义觅食策略，同时也可能反映同一个体在季节内取食不同食物资源以及夏季可利用资源更加多样化的影响。

研究人员在讨论中强调了鸟枪法宏基因组学的技术优势与局限。该方法能够从单一测序文库中同时检测植物、动物、真菌和微生物DNA，避免了类群特异性引物的限制，特别适用于复杂杂食性食性的表征。然而，相对读段丰度并不等同于实际摄食生物量，因为不同物种和组织间的DNA含量、消化率和降解速率存在差异。参考数据库的不完整性和保守基因组区域可能导致读段比对到多个近缘类群，增加错误分配风险。严格相似性阈值导致大量读段无法分类，而放宽阈值则提高了分类率但增加了分类模糊性，可能高估属级丰富度估计值。未分配读段可能源于高度降解的食性DNA、区域性类群参考序列不足以及非目标物质的摄入。次级消费（如猎物肠道内容物、寄生虫、藻类或无意识摄入物质）也可能导致稀有或意外类群的检出。

本研究的局限性包括：各县之间样本分布不均匀限制了空间比较的可靠性；未直接量化植被可用性、季节性食物丰度或人为食物来源的空间分布；未评估年龄和性别对食性特化的影响。未来研究应整合植被调查、人为食物可用性测量、GPS追踪数据和行为观察，以更机械地理解影响黑熊食性的因素。方法学进步，如食性DNA富集、宿主和微生物耗竭策略以及长读长测序技术，有望进一步提高食性DNA恢复和分类分辨率。

研究结论指出，鸟枪法宏基因组测序成功重建了美洲黑熊的食性，并揭示了食性结构的清晰季节性模式。食性以植物为主，动物类群贡献较小，强化了黑熊作为主要依赖植被并辅以动物性食物的广食性杂食动物的分类地位。食性组成在季节间显著变化，夏季丰富度更高，冬季食性更为受限，反映了资源可用性和物候的可预测变化。这些发现强调了营养灵活性和季节性资源追踪在塑造沙漠生态系统黑熊觅食生态学中的共同作用，并证明了鸟枪法宏基因组学在捕获复杂杂食性食性分类广度方面的潜力。该研究为管理人与熊的互动、优先保护栖息地以及在人类改造景观中监测重新定殖种群提供了直接的科学依据。