香椿无性系辅助筛选中氮归一化表型指数的多环境验证

《Industrial Crops and Products》：Multi-environment validation of nitrogen-normalized phenotypic indices for auxiliary clonal screening in the timber crop Toona sinensis

　　

研究人员建立了分级验证框架，将比值人为产物与生物学筛选价值分离。结构型氮归一化指数（S-NNI，LMA/LN）与非比值结构调整及栅栏组织厚度一致；S-NNI在叶厚与栅栏组织厚度的留一克隆交叉验证（LOCO）中R2最高。高度氮归一化指数（H-NNI，H/(LN+RN)）改善胸径（DBH）预测但未优于全组分模型。S-NNI支持有限预筛，H-NNI仅具探索性。以安徽六安、山东菏泽、河北邢台3点18无性系162株观测为材料，研究人员定义S-NNI=LMA/LN、H-NNI=H/(LN+RN)，经代数耦合、异速关系、非比值残差、外部解剖/生长准则、公平模型比较与位点内排序变化验证。结果表明两指数均非零克隆组分，S-NNI与位点及LN校正后结构残差RS Spearman ρ=0.734（0.559–0.830），与位点校正栅栏厚ρ=0.313（0.031–0.581），LT/PT的LOCO R2达0.176/0.163为六模型最高；H-NNI与高度残差RH ρ=0.478（0.280–0.593），与DBH ρ=0.576（0.336–0.751），DBH预测R2由0.865升至0.913但仍低于H+LN+RN模型0.939。研究人员指出S-NNI可作生产性状初选集内叶结构压缩预筛变量，H-NNI因无独立增量仅作探索排序诊断，二者均非氮营养指数（NNI）亦非氮利用效率。该框架可推广至杨、桉等多年生工业作物无性系育种。

研究背景与立项依据

香椿（Toona sinensis）为楝科多年生落叶乔木，是我国高价值用材树种，集约无性系林业依赖优良基因型选育。林木生产性状由基因型、环境及基因型×环境互作（G×E）共同决定，多点试验中无性系优势随环境变更，因此需在多环境中快速识别兼具生长量与可解释资源利用背景的无性系。氮是叶绿素、核酸及光合蛋白组分，叶氮浓度（LN）与根氮浓度（RN）反映器官营养背景，比叶重（LMA，单位叶面积干物质投入）属叶经济谱核心结构性状。将表型与组织氮浓度压缩为单变量比值（如S-NNI=LMA/LN、H-NNI=H/(LN+RN)）有望简化预筛，但比值自带数学耦合与比例假设风险，须以对称验证判定其是否保留可重复生物学信号。研究人员在安徽六安、山东菏泽、河北邢台设3站点随机区组试验，18无性系×3站×3株共162株观测，依托同一平台但补测LMA、LN、RN并借用已发表DBH与叶解剖量作外部准则，回答“氮归一化比值是否值得进入香椿无性系筛选流程”这一问题。

主要技术方法概括

研究人员采用三点18无性系162个体树队列，以混合模型估站点固定效应与无性系、G×E随机效应及Cullis广义重复性；通过Pearson相关与对数异速模型（含站点截距、检站点×氮交互与公共斜率）诊断代数耦合与比例假设；以非比值对数模型残差R_S、R_H作内部准则，克隆聚类自举5000次估Spearman置信区间；以位点校正S-NNI对栅栏厚（PT）、叶厚（LT）、海绵厚（ST）及H-NNI对DBH作外部收敛效度，并控LMA/LN或H/LN/RN作偏相关检独立增量；以留一克隆交叉验证（LOCO）在LT、PT、DBH上比较站点仅、NNI、加性组分、对数组分、交互组分、二次组分六类模型之R2与RMSE；位点内算LMA对S-NNI、H对H-NNI的Spearman秩相关及排序位移。

研究结果

3.1 两NNI的环境分化与跨环境筛选信号

混合模型显示S-NNI克隆方差占7.35%、G×E占32.71%、残差59.94%，Cullis 0.295；H-NNI相应3.80%、10.12%、86.07%，Cullis 0.226。LMA与LN跨环境克隆方差近零，而S-NNI保留非零克隆组分，说明该比值压缩出LMA-LN组合中部分结构分化；H-NNI重复性低于株高（0.355），仅宜作直接生长评价后探索信息。

3.2 NNI与组分性状及非比值校正的关系

S-NNI与LMA、LN相关0.887、?0.621；H-NNI与H、LN+RN相关0.915、0.267，证实比值继承分子信息。结构模型站点×LN交互不显著（P=0.532），公共斜率?0.030±0.115（P=0.798）；生长模型站点×(LN+RN)交互P=0.691，斜率0.024±0.107（P=0.823），数据不支持跨点稳定比例，故弃直接除法解释，转用残差。S-NNI与R_S ρ=0.734（0.559–0.830），H-NNI与R_H ρ=0.478（0.280–0.593），bootstrap CI均不含零，S-NNI对非比值结构排秩重现更强。

3.3 S-NNI的结构准则效度与预测表现

位点校正后S-NNI与PT ρ=0.313（0.031–0.581），与LT ρ=0.254（CI跨零），与ST无稳关联，即主要对应栅栏组织投入。LOCO中LT预测：站点仅R20.112，S-NNI 0.176最高，RMSE 20.832 μm低于加性/对数/交互模型；PT预测：站点仅0.049，S-NNI 0.163最高，RMSE 15.704 μm。但S-NNI较站点仅或二次模型RMSE改善CI跨零，且控LMA+LN后偏相关消失，故其为LMA-LN压缩预筛量而非独立生理轴。

3.4 H-NNI有限生长效度及与组分模型比较

H-NNI与位点校正DBH ρ=0.576（0.336–0.751）。DBH的LOCO：站点仅0.865，H-NNI 0.913，H+LN+RN 0.939最优，交互组分0.936，对数0.921，二次0.925。H-NNI比站点仅RMSE降0.212 cm（0.036–0.375），但H+LN+RN再降0.139 cm、交互再降0.120 cm；控H/LN/RN后偏相关CI跨零。H-NNI对DBH增益来自压缩H与组织氮信息，非独立信号；同高候选克隆下直接比LN、RN可保留器官级差异，H-NNI模糊此信息。

3.5 位点内排序调整与后续验证材料

位点内LMA-S-NNI秩相关六安0.934、菏泽0.953、邢台0.692；H-H-NNI六安0.752、菏泽0.496、邢台0.827。邢台NY10–5的S-NNI秩较LMA升9位，XC30–2降8位；菏泽XC18–4的H-NNI秩升10位，XC9–9降12位。前者供检S-NNI排秩变动是否对应叶结构差异，后者仅用于探H-NNI排秩冲突有无可重复生物学基础，不作生长次排。

讨论部分总结

研究人员强调NNI不是等同筛选价值：S-NNI吻合非比值结构残差与栅栏厚，可在生产性状初选集内提供叶结构第二层信息；H-NNI虽胜站点仅模型但全组分H+LN+RN更充分，故须指数级区分而非统称表型/氮比值。两指数站点间显著差异与非零G×E方差印证香椿既有多点G×E报道，排除通用阈值；S-NNI留克隆组分而LMA/LN近零，是其可保留结构分化之由。H-NNI重复性低于株高且预测逊于全组分，确认生长评价仍以绝对表型与原氮浓度为中心。方法边界上，研究人员把Kronmal与Curran-Everett的比值耦合风险转为“代数耦合—异速—非比值残差—外部准则—LOCO公平非线性比较”多级步骤，实现选择性保留：S-NNI限用于结构预筛，H-NNI降级为探索排序。局限为单年、每点3株、无全株生物量与器官氮库，LN/RN系浓度非吸收量，NNI非氮利用效率；叶解剖/DBH同平台同年属收敛非独立验证。展望要求独立年/点/控氮试验测生长增量、器官生物量、叶根氮库、净光合与土有效氮，并先验指定模型比较。

结论部分翻译

研究人员针对香椿多环境无性系筛选需求，建立氮归一化表型指数分级验证与选择性使用框架。S-NNI与非比值结构残差及栅栏组织厚度一致，且在LT与PT六模型LOCO中R2最高，故可作生产性状初选集内叶结构初步变量。反之H-NNI虽优于站点仅DBH预测，但相对保留H、LN、RN的联合模型无独立增益；直接分析株高、叶氮浓度与根氮浓度更透明且保留器官级差异，H-NNI仅用于标识绝对生长与氮归一化排秩强冲突，不进入最终无性系排秩。两指数均非氮利用效率，不替代株高、DBH、原组分性状与多环境稳定性评估。方法论结论是：同一验证框架可保留S-NNI作有限结构预筛，同时识别并将H-NNI降级因其缺独立增量信息。该研究发表于《Industrial Crops and Products》。