《International Dairy Journal》：Comparative hydrolysis of buffalo and cow milk casein-rich fractions and validation of buffalo-derived DPP-IV inhibitory peptides
编辑推荐：
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水牛酪蛋白在DPP-IV抑制肽的释放方面显示出更大的潜力。
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使用Flavourzyme酶水解3小时后，获得了最强的抑制活性。
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DPP-IV的抑制作用主要集中在<3 kDa的肽段中。
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Flavourzyme酶水解过程中伴随着可测量的
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水牛酪蛋白在DPP-IV抑制肽的释放方面显示出更大的潜力。
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使用Flavourzyme酶水解3小时后，获得了最强的抑制活性。
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DPP-IV的抑制作用主要集中在<3 kDa的肽段中。
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Flavourzyme酶水解过程中伴随着可测量的光谱变化。
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在四种测试的肽中，QPPQPLPPT和LPNTVP显示出最低的IC50值。
引言
2型糖尿病是一种以慢性高血糖为主要特征的代谢性疾病，已成为全球最严重的公共卫生挑战之一。目前的糖尿病干预策略主要针对关键酶，包括α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶-IV（DPP-IV），以改善葡萄糖代谢（Zhao等，2022年）。DPP-IV是一种关键的代谢酶，参与调节葡萄糖稳态。它迅速降解胰高血糖素样肽-1（GLP-1）和葡萄糖依赖性胰岛素促泌多肽（GIP），从而减少胰岛素分泌并损害血糖稳态（Kazeem等，2021年）。因此，抑制DPP-IV的活性被视为预防和管理2型糖尿病的重要营养策略（Shaikh等，2021年）。近年来，来源于食物的DPP-IV抑制肽因其天然来源、结构多样性和与功能性食品开发的兼容性而受到越来越多的关注。研究表明，DPP-IV抑制肽的活性与肽的长度、N端残基以及关键氨基酸的分布有关（Zhang等，2022年）。低分子量的肽，尤其是含有Pro或疏水残基的肽，通常表现出相对较强的DPP-IV抑制活性。因此，从高质量食物蛋白质中 targeted释放和高效筛选DPP-IV抑制肽对功能性食品的开发具有重要意义。
牛奶蛋白，尤其是酪蛋白，是DPP-IV抑制肽的重要前体。一方面，酪蛋白含量丰富且营养价值高，其一级结构中含有许多可通过靶向酶解释放的潜在生物活性片段。在N端第二位的Pro在来源于牛奶的DPP-IV抑制肽中普遍存在，并被认为是DPP-IV抑制的相关序列特征（Sayuri等，2024年）。先前的研究从牛乳蛋白中鉴定出几种新的DPP-IV抑制肽，并发现这些肽都在N端第二位含有Pro，这表明牛奶蛋白作为这类生物活性肽前体具有明显优势。一项关于牛酪蛋白的研究进一步显示，DPP-IV抑制肽的释放程度因蛋白酶的不同而有所差异。这种差异不仅取决于酶的切割特异性，还取决于它们的二级特异性以及释放Xaa-Pro型肽片段的能力（Wang等，2024年）。因此，水解程度与DPP-IV抑制活性之间的关系并不一定是线性的。较高的水解程度可能意味着更广泛的肽键切割，但并不能保证积累出具有适合DPP-IV抑制作用的长度、末端残基和序列基序的肽（Karami等，2023年）。在这种情况下，蛋白酶的特异性尤为重要。胰蛋白酶主要切割Lys和Arg羧基侧的肽键，而胰凝乳酶则倾向于在芳香族或大体积疏水残基之后进行切割（Vreeke等，2023年）。木瓜蛋白酶具有广泛的内肽酶活性，而Flavourzyme是一种同时具有内肽酶和外肽酶活性的复杂酶制剂。其内肽酶活性可能生成中间肽，而外肽酶活性可能进一步修剪肽的末端并促进较短肽的形成。这种组合活性可能有利于低分子量、含Pro和疏水残基的肽的释放或富集，这可以解释为什么DPP-IV抑制活性可能与肽的释放模式更为密切相关，而不是与水解的绝对程度相关。
与牛奶相比，水牛奶通常含有更高水平的蛋白质、脂肪和矿物质。水牛奶中的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的含量通常高于牛奶。特别是αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白的含量大约是牛奶的两倍（He等，2025年）。水牛奶还含有更高的总蛋白质、脂质和矿物质含量（Liao等，2025年）。这些差异表明，水牛酪蛋白在底物结构、酶切位点以及随后生物活性肽的释放方面可能与牛酪蛋白有所不同。几项 recent 研究从不同角度研究了水牛奶蛋白作为DPP-IV抑制肽来源的潜力。An等人评估了Flavourzyme对水牛奶酪蛋白的水解作用，描述了伴随的结构变化和DPP-IV抑制变化，并鉴定出YPFPGPIPN作为一种实验上具有活性的DPP-IV抑制肽。Zheng等人结合了肽组学、分子对接、体外抑制和Caco-2细胞实验，鉴定出水牛奶来源的DPP-IV抑制肽GPFPIIV和FPQYL。此外，Naji和?am比较了使用Flavourzyme和Neutrase水解的牛奶、水牛奶、山羊奶和绵羊奶中的酪蛋白水解物，重点关注水解特性、分子量分布、氨基酸组成和选定的生物活性。总体而言，这些研究确立了水牛奶蛋白作为生物活性肽来源的潜力，并提供了关于酪蛋白水解的重要信息。然而，它们没有在一个实验流程中同时比较水牛奶和牛奶经过多种蛋白酶处理和水解时间后酸沉淀的酪蛋白富集部分的DPP-IV抑制反应、所得水解物的分子量分馏以及从选定的水牛来源活性部分中验证候选抑制肽。因此，本研究的贡献在于这种综合比较-验证流程，而不仅仅是首次证明了水牛奶蛋白可以生成DPP-IV抑制肽（An等，2024年；Naji & ?am，2024年；Zheng等，2025年）。
因此，本研究在同一比较框架内比较了水牛奶和牛奶中的酸沉淀酪蛋白富集部分。对于每种蛋白酶处理，这两种牛奶来源都在相应的蛋白酶特异性反应条件下并行评估了它们的时间依赖性水解行为和DPP-IV抑制反应。进一步使用物理化学表征和分子量分馏来描述与水解相关的变化，并确定在测试浓度下显示出最高抑制反应的部分。随后对选定的水牛奶来源<3 kDa部分进行了lc–ms分析。
部分片段
材料
原始水牛奶和牛奶来自广西农垦西江乳业有限公司（中国广西贵港市）。提供的牛奶样品是散装牛奶，而不是从个别动物中收集的牛奶；因此，无法获得有关个体动物的信息，如产次和泌乳阶段。BCA蛋白质测定试剂盒来自云港天生物技术有限公司（上海）。十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、无水乙醇和冰冻...
水牛奶和牛奶的成分分析
牛奶和水牛奶的成分数据如图1a所示。在测试的样品中，水牛奶中的脂肪、蛋白质、灰分和非脂固体的含量高于牛奶，而乳糖含量较低。这种总体成分趋势与之前报道的水牛奶和牛奶之间的差异一致（Jiang等，2022年）。具体来说，测试的水牛奶样品中的蛋白质含量为4.52%，而牛奶样品中的蛋白质含量为3.25%...
结论
本研究比较评估了在测试水解条件下酸沉淀的水牛奶和牛奶酪蛋白富集部分。这两种制备物在物理化学特性、氨基酸组成、水解行为和DPP-IV抑制反应方面存在差异。在Flavourzyme处理下，水牛奶酪蛋白水解物显示出比相应的牛奶酪蛋白水解物更高的DPP-IV抑制作用，尽管活性模式并不完全对应于...
CRediT作者贡献声明
Chunmei Li：写作 – 审稿 & 编辑。Peng Du：写作 – 审稿 & 编辑，资金获取。Chun Li：写作 – 审稿 & 编辑。Congxin Dong：写作 – 初稿撰写，可视化，概念化。Zifu Zhao：写作 – 审稿 & 编辑。Tian Liu：写作 – 审稿 & 编辑。Chaofan Li：写作 – 审稿 & 编辑。Yiming He：写作 – 审稿 & 编辑。Yike Sun：写作 – 审稿 & 编辑。Guofang Zhang：写作 – 审稿 & 编辑。Libo Liu：写作 – 审稿 & 编辑。Zhicheng Chen：
数据可用性
本研究中的所有数据可根据相应作者的合理请求提供。数据尚未上传到公共可访问的数据库。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中央政府引导基金（针对地方科学和技术发展，2023-3年）和广西重点研发计划（编号2024AB33534）的支持。
