《Frontiers in Endocrinology》：CCN1-induced senescence and dysfunction of umbilical cord blood endothelial colony-forming cells in the pathogenesis of preeclampsia
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摘要引言：母体血管功能障碍和胎盘血管生成受损是先兆子痫（PE）的关键特征。脐带血来源的内皮集落形成细胞（CB-ECFCs）有助于胎儿内皮修复和血管网络形成，但其在PE中的表型仍不完全清楚。方法：研究人员探讨了基质细胞蛋白CCN1是否与CB-ECFC衰老和功能障
摘要引言：母体血管功能障碍和胎盘血管生成受损是先兆子痫（PE）的关键特征。脐带血来源的内皮集落形成细胞（CB-ECFCs）有助于胎儿内皮修复和血管网络形成，但其在PE中的表型仍不完全清楚。方法：研究人员探讨了基质细胞蛋白CCN1是否与CB-ECFC衰老和功能障碍相关。研究人员从PE妊娠（n=8）和健康妊娠（n=9）中分离CB-ECFCs。通过SA-β-半乳糖苷酶染色、qPCR和衰老相关标记物及衰老相关分泌表型因子的Western blotting评估细胞衰老。将对照来源的CB-ECFCs暴露于重组CCN1，联合或不联合γ-分泌酶抑制剂DAPT，检测衰老相关蛋白、裂解的Notch1、氧化还原反应蛋白HO-1、炎症因子TNF-α和DNA损伤反应标记物γ-H2AX。结果：PE来源的CB-ECFCs显示出集落产量减少、衰老相关标记物增加以及分泌型和细胞相关CCN1表达升高。重组CCN1增加了衰老相关标记物、裂解的Notch1、HO-1、TNF-α和γ-H2AX，并损害了CB-ECFC的代谢活性、迁移和管形成。DAPT减弱了部分分子变化并部分恢复了管形成，但未恢复伤口愈合。讨论：这些发现确定CCN1升高是PE来源CB-ECFCs的一个特征，并支持CCN1暴露、Notch1信号传导、氧化应激与CB-ECFC衰老和功能障碍之间的关联。CCN1/Notch1轴可能代表了PE中胎儿-胎盘内皮功能障碍的潜在机制。
**论文解读：CCN1与先兆子痫中脐带血内皮集落形成细胞衰老及功能障碍的关联研究**
**一、研究背景与目的**
先兆子痫（preeclampsia, PE）是一种多因素参与的妊娠期特异性高血压疾病，影响全球2%–8%的妊娠，以妊娠20周后新发高血压和蛋白尿为特征，是孕产妇和围产期 morbidity 与 mortality 的重要原因。PE的病理机制虽未完全阐明，但母体血管内皮功能障碍和胎盘血管重塑异常被认为是其核心环节。内皮集落形成细胞（endothelial colony-forming cells, ECFCs）是内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）中增殖能力最强、具备体内成血管能力的亚型；脐带血来源的内皮集落形成细胞（cord blood-derived endothelial colony-forming cells, CB-ECFCs）在胎盘血管发育和胎儿内皮修复中发挥关键作用。既往研究发现PE患者循环中EPCs数量减少，且其迁移和血管生成能力受损，但CB-ECFCs在PE中的具体病理表型及其分子机制尚不清楚。细胞衰老（cellular senescence）是内皮功能障碍的重要驱动因素，衰老的内皮祖细胞增殖和修复能力显著下降。CCN1（又称CYR61）是CCN家族基质细胞蛋白成员，既往研究已证实其可通过多种机制促进细胞衰老，且胎盘组织中CCN1表达升高与PE发病相关。Notch信号通路在胎盘发育和血管重塑中发挥关键调控作用，且PE患者EPCs中Notch1表达显著升高。基于上述背景，研究人员提出假设：CCN1可能通过Notch1相关的氧化应激和DNA损伤途径介导CB-ECFC衰老与功能障碍，从而参与PE的发病机制。该研究旨在检测PE来源CB-ECFCs中CCN1表达和衰老状态，并探讨外源性CCN1对CB-ECFC功能的影响及潜在分子机制。
**二、主要技术方法**
研究人员从同济大学附属上海第十人民医院收集PE妊娠（n=8）和健康妊娠（n=9）的脐带血样本，采用密度梯度离心法分离单个核细胞并进行CB-ECFC培养和表型鉴定。主要技术方法包括：SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色评估细胞衰老；实时定量PCR（qPCR）和Western blot检测衰老相关标记物（p16、p21、p53、pRb）及衰老相关分泌表型（SASP）因子（TNF-α、MCP-1）；MTT法检测细胞增殖活性；伤口愈合实验评估细胞迁移能力；Matrigel管形成实验评估血管生成能力；免疫荧光染色检测CCN1定位及Ki67表达；采用γ-分泌酶抑制剂DAPT进行Notch信号通路的药理学阻断实验。
**三、研究结果**
**1. 临床特征与ECFC表征**
临床数据显示，PE组收缩压和舒张压显著高于对照组（p<0.001），胎儿出生体重显著低于对照组（p=0.011），而两组间母体年龄、BMI、受孕方式、剖宫产率及婴儿性别等无显著差异。体外培养显示，PE组脐带血ECFC集落数量较对照组显著减少（1.5±0.9 vs 3.0±1.1，p=0.009），表明PE中CB-ECFC集落形成能力受损。
**2. PE患者CB-ECFCs的细胞衰老**
SA-β-Gal染色显示，PE来源CB-ECFCs的衰老细胞比例显著高于对照组（p<0.001）。qPCR结果证实衰老相关标记物p16、p21和p53的mRNA表达水平显著升高。Western blot进一步显示，PE组培养上清中SASP相关分泌蛋白TNF-α（p=0.0274）和MCP-1（p=0.0397）水平明显增加。上述结果提示PE中CB-ECFCs存在加速衰老的表型。
**3. PE患者ECFCs中CCN1表达升高**
Western blot检测显示，PE来源CB-ECFCs培养上清中分泌型CCN1水平显著升高（p=0.0464）；同时，膜结合型CCN1在蛋白（p=0.0274）和mRNA（p=0.0152）水平均显著上调。免疫荧光染色证实CCN1主要定位于CB-ECFCs的细胞膜区域，提示CCN1可能参与膜相关信号转导过程。
**4. CCN1抑制CB-ECFCs增殖、血管生成和迁移**
MTT实验显示，100 ng/mL CCN1处理48小时可显著抑制CB-ECFC增殖，500 ng/mL CCN1在24小时和48小时均显著抑制增殖。Western blot和免疫荧光检测显示CCN1处理组Ki67（增殖标记物）表达降低。伤口愈合实验表明500 ng/mL CCN1显著损害细胞迁移能力。管形成实验显示CCN1减少血管网络形成，表现为总管长度、分支数和连接点数量减少。以上结果表明外源性CCN1可损害CB-ECFCs的增殖、迁移和血管生成功能。
**5. CCN1通过Notch1介导的氧化应激和DNA损伤加速CB-ECFCs衰老**
SA-β-Gal染色显示500 ng/mL CCN1显著诱导CB-ECFC衰老，Western blot检测证实p21、p16、pRb和p53蛋白水平升高。同时，CCN1处理组裂解的Notch1（cleaved Notch1）表达显著上调（p=0.0182）。进一步的分子检测显示，氧化应激标志物HO-1和TNF-α以及DNA损伤标志物γ-H2AX的表达均随CCN1浓度增加而升高。这些发现表明CCN1诱导的CB-ECFC衰老可能由Notch1激活下游的氧化应激和DNA损伤所驱动。
**6. DAPT减弱CCN1相关的分子和功能改变**
使用γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路后发现：DAPT可显著降低CCN1诱导的衰老标记物p21、p16、pRb、p53表达上调，减少cleaved Notch1的产生，并降低氧化应激蛋白HO-1和DNA损伤标志物γ-H2AX的表达。功能实验显示，DAPT部分恢复了CCN1损害的内皮细胞管形成能力（包括总长度、连接点、网格和节段数量），但未能恢复CCN1导致的伤口愈合障碍。这表明管形成和细胞迁移对γ-分泌酶抑制的反应存在差异，其具体机制尚待阐明。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，该研究证实了PE来源CB-ECFCs以CCN1表达升高和加速衰老为特征，外源性重组CCN1可模拟PE样CB-ECFC功能障碍，包括增殖抑制、迁移受损、管形成能力下降以及衰老相关分子标志物的增加，这些效应与裂解的Notch1、应激反应和DNA损伤反应标记物的升高密切相关。DAPT对上述分子改变和管形成障碍的部分逆转作用支持γ-分泌酶敏感的Notch信号参与该过程。然而，研究存在局限性：样本量较小且对照样本被分配至不同干预实验；研究主要基于体外实验，尚未在体内验证CCN1相关CB-ECFC衰老与胎盘血管重塑之间的关联；DAPT并非Notch1特异性抑制剂，无法排除脱靶效应；HO-1仅是细胞氧化还原调节的间接指标，未直接测量细胞内ROS；γ-H2AX作为DNA损伤标志物不足以全面反映损伤特征，也未检测p-ATM和53BP1等其他标志物。
研究结论：来自先兆子痫妊娠的CB-ECFCs表现出衰老增加和细胞功能障碍，并伴有CCN1表达升高。体外暴露于重组CCN1可重现多种衰老相关的分子和功能改变，并伴随cleaved Notch1及应激和DNA损伤反应标记物的增加。DAPT对这些效应的部分减弱表明，γ-分泌酶敏感的Notch相关信号传导可能参与该反应。这些发现支持CCN1、Notch相关信号传导与先兆子痫中CB-ECFC功能障碍之间存在功能关联；然而，其潜在的因果机制及其与胎盘内皮功能障碍的相关性仍需进一步的遗传学、生物化学和体内实验验证。该研究为理解PE中胎儿-胎盘内皮功能障碍的分子机制提供了新的视角，CCN1/Notch1轴可能成为PE潜在的治疗靶点。该论文发表于《Frontiers in Endocrinology》。
