《Frontiers in Aging Neuroscience》：Astragaloside IV attenuates hypoxia-reoxygenation-induced endothelial senescence and vascular inflammation by modulating the NOTCH1/VCAM-1 axis
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目的：阿尔茨海默病（AD）的进展涉及脑低灌注诱导的脑微血管内皮细胞衰老，这会导致血脑屏障（BBB）功能障碍。尽管已知Notch1信号传导通过血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）加剧内皮衰老和神经炎症，但其在介导AD中缺氧诱导的内皮衰老机制仍不清楚。此外，尽管已
目的：阿尔茨海默病（AD）的进展涉及脑低灌注诱导的脑微血管内皮细胞衰老，这会导致血脑屏障（BBB）功能障碍。尽管已知Notch1信号传导通过血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）加剧内皮衰老和神经炎症，但其在介导AD中缺氧诱导的内皮衰老机制仍不清楚。此外，尽管已证明黄芪甲苷IV（AS-IV）能缓解AD中的脑低灌注，但其是否通过直接调节Notch1/VCAM-1轴发挥作用尚属未知。本研究旨在确定AS-IV是否通过调节Notch1/VCAM-1通路来减轻内皮衰老和AD病理。
方法：对AD患者数据的转录组学分析和网络药理学将NOTCH1确定为一个关键靶点。分子对接和100纳秒分子动力学模拟（使用Desmond）表征了AS-IV与Notch1之间的相互作用。使人脑微血管内皮细胞（HBMECs）经受缺氧-复氧（HR）以模拟AD相关的低灌注。用AS-IV（25、50或100 μM）或N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为阳性抗氧化对照处理细胞。使用重组诱饵受体在实验上调节Notch1信号传导以模拟信号阻断，从而与HR诱导的过度激活形成对比。评估包括CCK-8实验、MDA和ROS检测、qPCR和蛋白质印迹法。
结果：AD患者中NOTCH1表达上调。分子对接和动力学模拟预测AS-IV与Notch1之间存在稳定的结合模式。HR暴露显著增加氧化应激并上调衰老标志物（p16、p21和p53）、促炎衰老相关分泌表型（SASP）因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）以及Notch1/VCAM-1的表达。相反，AS-IV治疗改善细胞活力，降低氧化应激（功效与NAC相当），并下调Notch1/VCAM-1、衰老和SASP标志物。值得注意的是，无论是HR诱导的过度激活还是诱饵受体介导的阻断引起的Notch信号干扰，都会加剧衰老表型。重要的是，AS-IV共处理有效挽救了由两种形式的Notch通路失调引起的细胞损伤。
结论：AS-IV通过调节Notch1/VCAM-1轴减轻HR诱导的内皮衰老。研究人员的这些数据表明，AS-IV不仅仅抑制Notch1，而是通过将其信号传导调节至保护性平衡状态来发挥作用，从而减轻内皮衰老和与恢复Notch1/VCAM-1信号平衡相关的炎症。这些发现突出了AS-IV作为AD血管病变治疗候选药物的潜力。
研究背景：阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种隐匿起病、致病机制复杂的进行性神经退行性疾病。除了经典的淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）和tau蛋白病理外，脑微血管功能障碍在AD进展中作为早期驱动因素的作用日益受到重视。这种功能障碍表现为血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏和内皮衰老，并不仅仅是继发现象。内皮衰老伴随促炎的衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）释放，如白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）等，加剧神经元损伤。Notch1信号通路在脑灌注不足和缺血时上调，损害血管重塑并破坏BBB完整性，其通过转录诱导血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）在神经血管单元中促进促炎和衰老微环境。黄芪甲苷IV（Astragaloside IV, AS-IV）是一种从黄芪中提取的活性三萜皂苷，具有抗氧化、抗炎和神经保护特性，并能透过BBB。然而，AS-IV是否通过直接调节Notch1/VCAM-1轴来缓解AD相关的内皮衰老尚不清楚。因此，研究人员开展了这项研究，旨在探讨AS-IV是否通过调节该信号轴减轻脑微血管内皮细胞的衰老和AD病理，该研究对于开发针对AD血管病变的新型疗法具有重要意义，相关成果发表在《Frontiers in Aging Neuroscience》。
技术方法：研究人员结合AD患者转录组数据（GEO数据库GSE122063）与网络药理学分析筛选核心靶点；运用分子对接及100纳秒分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟预测AS-IV与Notch1的结合模式；采用人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells, HBMECs）构建缺氧-复氧（hypoxia-reoxygenation, HR）模型模拟AD脑低灌注，并施加AS-IV或N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine, NAC）干预；利用重组Notch1诱饵受体阻断内源性信号传导；通过CCK-8法、丙二醛（malondialdehyde, MDA）与活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测、定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）及蛋白质印迹法评估细胞损伤、氧化应激及衰老相关指标。
研究结果：
阿尔茨海默病关键差异基因分析：通过对AD患者转录组数据进行分析，研究人员鉴定出差异表达基因。功能富集分析显示这些基因涉及细胞内通讯、细胞周期调节和炎症通路等。在变异最显著的基因中，NOTCH1被确定为与脑血管功能相关的核心基因。
网络药理学与分子对接预测AS-IV与Notch1结合：网络药理学分析筛选出AS-IV与AD的157个重叠靶标，蛋白质-蛋白质相互作用网络分析将NOTCH1确立为核心枢纽基因。分子对接模拟表明AS-IV稳定结合在Notch1蛋白的表面口袋中，对接得分为?8.607 kcal/mol，该相互作用由疏水接触和多个氢键稳定。
分子动力学模拟提示稳定的结合模式：100纳秒全原子MD模拟显示，AS-IV-Notch1复合物的均方根偏差在约50纳秒后达到平台期，暗示系统达到平衡。均方根涨落分析揭示了配体结合后的潜在诱导契合区域。相互作用分析证实关键残基在整个模拟过程中维持了持久的氢键和疏水接触，计算得出的平均结合自由能ΔGbind为?44.5 kcal/mol，为AS-IV调节Notch1提供了理化基础。
AS-IV减轻HR诱导的内皮衰老与氧化应激：在HBMECs的HR模型中，AS-IV显著提升细胞活力，并降低MDA和ROS水平，其抗氧化功效与NAC相当。HR显著上调了NOTCH1信使核糖核酸（mRNA）及衰老与SASP相关转录本，而AS-IV治疗有效抑制了Notch1的过度表达，并下调了细胞周期停滞及SASP相关基因。
AS-IV缓解Notch信号阻断诱导的内皮衰老：使用重组Notch1诱饵受体阻断内源性信号后，同样引发了显著的细胞应激反应，表现为氧化应激增加及VCAM1、衰老/SASP转录本水平升高。AS-IV共处理有效挽救了由信号阻断引起的细胞损伤。这表明Notch信号的过度激活和不足均是有害的，而AS-IV能够双向调节，恢复信号传导平衡。
讨论部分总结：脑血管功能障碍，特别是BBB破坏和微血管内皮衰老，是AD病理的关键贡献者。在缺血/缺氧应激下，Notch1的异常激活是连接血管损伤与衰老内皮表型的关键。持续的Notch1信号触发受体裂解并释放Notch胞内域（Notch intracellular domain, NICD），进而直接促进VCAM1转录，导致白细胞粘附、促炎微环境及ROS产生，最终引发细胞衰老。AS-IV并非单向抑制剂，而是Notch1/VCAM-1轴的稳态调节剂，能够将信号重校准至保护性平衡状态，从而减轻血管衰老，这不同于合成γ-分泌酶抑制剂通过完全阻断导致的脱靶毒性。研究也存在一定局限性，如急性HR模型无法完全模拟AD慢性病理，缺乏NICD的直接测量，且仅评估了转录标志物。
研究结论：总而言之，研究人员的研究阐明AS-IV通过恢复Notch1/VCAM-1轴的稳态来减轻内皮衰老，支持了一个与调节该信号轴相关的工作模型。AS-IV似乎不是作为简单的抑制剂，而是作为稳态调节剂发挥作用，既能减轻Notch信号的病理性过度激活，也能减轻其有害抑制，尽管尚需该机制的遗传学验证。鉴于越来越认同血管功能障碍是AD病理的活跃驱动因素，保留神经血管完整性的治疗策略至关重要。AS-IV通过这一明确通路改善脑血管功能的潜力，使其成为AD治疗的有望候选药物。
