《Frontiers in Oncology》：Aryl hydrocarbon receptor promotes the proliferation and aggressive progression of colorectal cancer under high-fat diet via activating INPP4B/AKT/SGK3 signaling pathway
**摘要**
**引言：**流行病学证据证实，高脂饮食（high-fat diet, HFD）是结直肠癌（colorectal cancer, CRC）进展的关键危险因素。芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）是一种富集于肠道组织中的配体依赖性核转录因子，可调节肠道代谢和肿瘤发生。然而，其在HFD诱导的CRC进展中的作用及机制尚不清楚。
**方法：**本研究构建了HFD诱导的肥胖CRC荷瘤小鼠模型以及游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）处理的CRC细胞模型，以探讨AhR在HFD相关CRC中的功能及机制。
**结果与讨论：**研究人员发现，HFD显著促进CRC进展，伴随AhR的激活，犬尿氨酸（kynurenine, KYN）合成相关酶水平上调，肿瘤组织和外周血中KYN水平升高。特异性抑制AhR可缓解HFD处理的荷瘤小鼠的肿瘤生长和转移。在体外，FFA处理诱导AhR激活并伴随高水平的KYN分泌，从而增强CRC细胞生长、侵袭和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。基因敲低AhR可逆转FFA诱导的恶性表型。定量蛋白质组学分析鉴定出肌醇多磷酸4-磷酸酶II型（inositol polyphosphate 4-phosphatase type II, INPP4B）可能是AhR功能的潜在靶点。机制上，激活的AhR直接转录上调INPP4B，从而触发AKT/SGK3通路激活，而敲低INPP4B可消除AhR激活诱导的致癌效应。总之，AhR通过激活INPP4B/AKT/SGK3通路促进HFD相关的皮下肿瘤生长及CRC侵袭/迁移相关表型，这可能为预防或治疗HFD相关CRC提供潜在靶点。
**论文解读：高脂饮食通过AhR/INPP4B/AKT/SGK3轴驱动结直肠癌恶性进展的机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居前列。近年来，随着高脂、高热量饮食模式的普及，CRC的全球疾病负担持续加重。大量流行病学证据表明，高脂饮食（high-fat diet, HFD）和肥胖不仅是CRC发病的危险因素，还可通过代谢重编程和脂质代谢紊乱加速肿瘤进展。然而，HFD相关CRC进展的分子机制尚未完全阐明，这限制了针对该类肿瘤的精准防治策略的开发。
芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AhR）是一种配体激活的碱性螺旋-环-螺旋Per-ARNT-Sim（bHLH-PAS）转录因子家族成员，在肠道组织中高表达，作为连接环境、饮食和代谢信号与基因转录程序的重要分子传感器。AhR可被多种外源性和内源性配体激活，其中包括色氨酸代谢产物犬尿氨酸（kynurenine, KYN）。以往研究已证实AhR参与调节肠道稳态、炎症反应和肿瘤发生，但AhR在HFD相关CRC进展中的具体作用和下游分子机制仍不清楚。
肌醇多磷酸4-磷酸酶II型（inositol polyphosphate 4-phosphatase type II, INPP4B）是磷酸肌醇信号的关键调节因子，通过调控PI(3,4)P?和PI(3)P的胞内平衡，进而影响下游信号通路活性。近年来研究表明，INPP4B在CRC组织中表达显著升高，并与不良临床预后相关，提示其在CRC中可能发挥促癌作用。然而，AhR是否通过调控INPP4B/AKT/SGK3信号通路参与HFD诱导的CRC进展，此前尚未见报道。
基于上述背景，研究人员推测AhR可能在HFD相关CRC中发挥重要调控作用，并围绕这一科学假设开展了系统研究，旨在阐明AhR在HFD诱导的CRC进展中的功能角色及分子机制，为HFD相关CRC的防治提供潜在分子靶点。
**二、主要技术方法**
本研究采用了体内外相结合的实验策略。在体内实验中，研究人员使用C57BL/6J小鼠建立HFD诱导的肥胖CRC皮下异种移植瘤模型，采用CT26小鼠结肠癌细胞接种，并给予AhR特异性拮抗剂CH-223191进行药物干预。在体外实验中，研究人员使用HCT116人结肠癌细胞和CT26小鼠结肠癌细胞，利用游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）混合物处理模拟高脂微环境，并运用基因敲低（shRNA/siRNA）和过表达质粒转染技术进行功能研究。研究涉及的主要关键技术包括：蛋白质印迹法（Western blot）、免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）、免疫荧光、双荧光素酶报告基因实验、定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、定量蛋白质组学质谱分析、生物信息学分析（TCGA和GEO数据库挖掘、GO/KEGG富集分析、OTTER靶点排序算法），以及Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险回归模型等。
**三、研究结果**
**3.1 HFD增强肥胖相关代谢表型并加速体内CRC进展**
研究人员通过HFD喂养建立肥胖CRC荷瘤小鼠模型，发现HFD组小鼠体重增长显著加快，血清甘油三酯（triglycerides, TG）、总胆固醇（total cholesterol, TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平显著升高，空腹血糖水平明显上升，表明HFD成功诱导了全身代谢紊乱。肿瘤生长曲线和瘤重测量显示，HFD组小鼠的肿瘤体积和重量均显著大于正常饮食组。免疫组织化学染色进一步证实，HFD组肿瘤组织中增殖标志物Ki67阳性细胞比例显著增加，基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2, MMP2）和MMP9的表达水平明显上调，提示HFD促进了CRC的增殖和侵袭相关表型。
**3.2 HFD激活CRC组织中的KYN/AhR信号通路**
研究人员检测了HFD条件下肿瘤组织中AhR信号通路的激活状态。结果显示，HFD组肿瘤组织中AhR总蛋白水平无明显变化，但核内AhR蛋白水平显著升高，提示AhR发生了核转位和激活。与此一致，AhR经典下游靶基因Cyp1a1和Cyp1b1的mRNA表达水平在HFD组肿瘤组织中显著上调。进一步检测KYN合成通路关键酶发现，吲哚胺2,3-双加氧酶1（indoleamine 2,3-dioxygenase 1, IDO1）、色氨酸2,3-双加氧酶（tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2）和芳基甲酰胺酶（arylformamidase, AFMID）的mRNA水平在HFD组显著升高，而色氨酸羟化酶1（tryptophan hydroxylase 1, TPH1）表达下调。相应地，HFD组小鼠肿瘤组织和血清中KYN浓度均显著升高。这些结果证实HFD促进了CRC组织中KYN/AhR信号轴的激活。
**3.3 FFA诱导CRC细胞中KYN/AhR通路激活**
体外实验中，研究人员用FFA处理HCT116和CT26细胞，发现FFA处理显著促进细胞增殖，并呈时间依赖性上调细胞中AhR的蛋白表达和核转位水平。FFA处理还显著增加了Cyp1a1和Cyp1b1的mRNA表达，促进了KYN的分泌。此外，外源性KYN处理同样以剂量依赖方式促进细胞活力，表明FFA诱导的KYN/AhR通路激活对CRC细胞生长至关重要。
**3.4 抑制或敲低AhR逆转FFA诱导的CRC细胞增殖、侵袭、迁移和EMT**
研究人员通过药理学抑制剂CH-223191和基因敲低（shAhR）两种策略验证了AhR在FFA诱导的恶性表型中的功能必要性。结果显示，CH-223191以剂量依赖性方式显著抑制FFA诱导的细胞增殖。shAhR转染有效敲低AhR表达后，FFA诱导的细胞增殖加速被显著抑制。Transwell侵袭实验和划痕愈合实验表明，shAhR显著削弱了FFA增强的细胞侵袭和迁移能力。同时，shAhR有效逆转了FFA诱导的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）标志物变化，恢复了上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，并抑制了间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和ZEB1的表达。
**3.5 药理学抑制AhR在体内抑制HFD促进的CRC生长和侵袭性进展**
在HFD荷瘤小鼠模型中，研究人员给予CH-223191（10或20 mg/kg/d）或多柔比星（doxorubicin, DOX, 5 mg/kg）作为阳性对照药物，持续给药2周。结果显示，CH-223191（20 mg/kg/d）和DOX处理均显著缩小了肿瘤体积和重量。IHC染色显示，CH-223191和DOX处理组肿瘤组织中Ki67阳性细胞比例显著降低，MMP2阳性染色面积明显减少。这些体内实验结果进一步证实了靶向AhR通路可有效抑制HFD促进的CRC生长和侵袭。
**3.6 定量蛋白质组学和生物信息学分析鉴定INPP4B为AhR的关键下游靶点**
研究人员对HFD组和正常饮食组的肿瘤组织进行了定量蛋白质组学质谱分析，共鉴定出176个差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），其中101个上调、75个下调。Gene Ontology（GO）功能富集分析显示这些DEPs主要参与代谢重编程、细胞增殖和迁移相关生物过程。KEGG通路富集分析表明，脂质代谢通路、PI3K/AKT通路、溶酶体、肌动蛋白细胞骨架和致癌受体信号级联显著富集。通过将DEPs与已知AhR靶基因取交集获得64个重叠候选蛋白，进一步结合OTTER排序算法和三维韦恩图分析，最终将候选范围缩小至12个核心差异基因，并从中确定INPP4B为AhR下游的关键靶点。
**3.7 INPP4B表达与CRC患者临床病理特征及预后的相关性**
研究人员利用TCGA COAD数据集（n=258）和GEO数据集（GSE72970、GSE161158）进行生物信息学分析。结果显示，INPP4B在多种人类恶性肿瘤中呈现组织特异性表达模式，在结肠癌组织中高表达。TCGA队列的Kaplan-Meier生存分析显示，INPP4B高表达组患者的总生存期显著短于低表达组。临床病理特征关联分析表明，INPP4B高表达与淋巴结转移（P=0.008）和神经周围浸润（P=0.020）显著正相关。单因素Cox回归分析显示INPP4B高表达是预后不良的危险因素（HR=1.382, P=0.018），但多因素分析中其独立预后价值被淋巴结转移和分期等强预后因素稀释（HR=1.201, P=0.196），提示INPP4B可能通过促进转移间接影响患者生存。GSE72970队列验证分析显示INPP4B高表达组死亡风险增加（HR=3.949, Cox P=0.0267），GSE161158队列显示高表达组复发/疾病进展风险增加（HR=2.524, Cox P=0.0174）。时间依赖性ROC曲线分析显示，INPP4B表达在3年和5年生存预测中的AUC值分别为0.623和0.669。
**3.8 AhR转录上调INPP4B表达并激活AKT/SGK3通路**
研究人员通过体内外实验验证了AhR对INPP4B的调控机制。HFD组肿瘤组织中INPP4B的蛋白和mRNA水平显著升高，而CH-223191处理以剂量依赖性方式降低INPP4B蛋白表达。在FFA刺激下，shAhR敲低显著抑制了FFA诱导的INPP4B蛋白和mRNA水平升高，同时抑制了AKT（Ser473和Thr308位点）和SGK3的磷酸化水平。外源性KYN处理以剂量依赖方式上调INPP4B的蛋白和mRNA表达。双荧光素酶报告基因实验证实，AhR过表达可显著增强INPP4B启动子驱动的荧光素酶活性，表明AhR直接结合INPP4B启动子区域并转录调控其表达。
**3.9 敲低INPP4B减弱KYN诱导的CRC细胞增殖、侵袭、迁移和EMT信号激活**
研究人员在HCT116和CT26细胞中转染靶向INPP4B的小干扰RNA（siINPP4B）进行功能回补实验。CCK-8实验表明，siINPP4B有效抑制了KYN诱导的细胞增殖。Transwell侵袭实验和划痕愈合实验显示，siINPP4B显著削弱了KYN增强的细胞侵袭和迁移能力。Western blot分析表明，siINPP4B逆转了KYN诱导的AKT和SGK3磷酸化水平的增加，恢复了E-cadherin的表达，并抑制了N-cadherin、Vimentin和ZEB1的表达。这些结果表明，INPP4B是KYN激活的AhR信号传导促进CRC恶性表型的关键下游分子节点。
**四、讨论与结论**
本研究系统阐明了AhR在HFD诱导的CRC进展中的功能与机制。研究结果表明，HFD通过增加内源性AhR配体KYN的积累，促进AhR激活和核转位，激活的AhR直接转录上调INPP4B表达，进而激活AKT/SGK3信号通路，最终促进CRC细胞的EMT和侵袭迁移表型。值得注意的是，研究人员在讨论中指出，INPP4B在不同肿瘤类型中表现出双向调控作用，在CRC中主要发挥促癌功能，其机制可能涉及INPP4B将PI3K信号从经典的AKT依赖模式转向SGK3依赖模式。此外，蛋白质组学分析显示HFD显著影响细胞骨架重塑、膜动力学、溶酶体和胞内运输相关通路，提示AhR/INPP4B信号轴可能还参与调控细胞骨架动力学和膜运输过程。研究人员也客观指出了本研究的局限性，包括未使用高转移性CRC细胞系和原位自发转移模型，将在后续研究中进一步完善。
综上所述，本研究揭示了一条HFD促进CRC进展的新机制，即HFD诱导的KYN积累激活AhR/INPP4B/AKT/SGK3信号级联反应。该研究深化了对AhR在肿瘤代谢重编程中作用的认识，为HFD相关CRC的预防和治疗提供了潜在的新靶点——AhR/INPP4B信号轴，具有重要的基础研究价值和临床应用前景。该论文发表于《Frontiers in Oncology》。
