穿心莲内酯通过破坏SDHA–SDHAF4组装介导的线粒体代谢稳态，促进三阴性乳腺癌的铁死亡及对多柔比星的敏感性

《Cellular & Molecular Biology Letters》：Andrographolide disrupts SDHA–SDHAF4 assembly-mediated mitochondrial metabolic homeostasis to promote ferroptosis and doxorubicin sensitivity in triple-negative breast cancer

　　

摘要

背景

三阴性乳腺癌（TNBC）对化疗仍表现出高度耐药性，这主要归因于其对阿霉素（DOX）等蒽环类药物的凋亡相关耐药机制。铁死亡是一种铁依赖性、脂质过氧化驱动的受调控细胞死亡方式，已成为规避凋亡逃逸的有前景策略。然而，TNBC中可临床操作的铁死亡诱导靶点仍不明确。特别是线粒体复合体II组装是否参与铁死亡和化疗耐药尚未阐明，且迄今尚无小分子化合物被报道可直接靶向琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚基A（SDHA，即线粒体复合体II的催化核心组分），或干扰其与琥珀酸脱氢酶复合体组装因子4（SDHAF4）的相互作用。

方法

通过透射电子显微镜、脂质过氧化检测以及细胞内Fe²⁺、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）水平测定来评估铁死亡反应。利用药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）实验、细胞热移位试验（CETSA）、质谱分析、pull down实验、表面等离子体共振（SPR）分析以及分子对接进行靶点鉴定。通过共免疫沉淀和分子动力学模拟检测SDHA–SDHAF4复合体的解离情况。采用核蛋白分离和共聚焦显微镜确定核定位，并通过共免疫沉淀分析蛋白质琥珀酰化修饰。

结果

我们鉴定出从穿心莲中分离得到的天然二萜类化合物穿心莲内酯（AG），它是首个被报道可直接靶向SDHA并破坏SDHA–SDHAF4组装的小分子化合物。AG能强力诱导铁死亡、抑制TNBC细胞增殖，并在TNBC二维细胞系和三维患者来源类器官中增强DOX敏感性。AG增加脂质过氧化、Fe²⁺积累、ROS和MDA水平，而铁死亡抑制剂或ROS清除剂可削弱这些效应。体内实验中，AG与DOX协同抑制TNBC肿瘤生长，且未检测到明显的全身毒性。机制上，SDHA——线粒体复合体II的催化亚基——被鉴定为AG的直接分子靶点。结构和生化分析表明，AG在Arg451和His407位点结合，破坏SDHA–SDHAF4相互作用，损害SDHA成熟并 destabilizing 复合体II组装。重要的是，本研究首次证明SDHA–SDHAF4组装完整性是调控铁死亡敏感性和化疗耐药的关键代谢检查点。该组装的破坏触发了两条趋同的铁死亡信号：过量的ROS生成和琥珀酸积累介导的Keap1琥珀酰化，进而激活Nrf2/HO-1通路。临床上，SDHA高表达与TNBC不良预后相关，且在肺癌和胃癌中与DOX敏感性降低相关，这与AG在这些模型中的化疗增敏效应一致。值得注意的是，SDHA敲低进一步增强了AG诱导的铁死亡。

结论

本研究鉴定AG为首个靶向SDHA并破坏SDHA–SDHAF4组装的天然小分子抑制剂。更重要的是，本研究首次揭示SDHA–SDHAF4复合体完整性调控铁死亡敏感性和蒽环类耐药性，发现了一个此前未被认知的以SDHA为中心的代谢脆弱性，该脆弱性可被用于治疗干预以诱导铁死亡并克服DOX耐药。