《Journal of Histochemistry & Cytochemistry》：Detection of Human Cytomegalovirus lncRNA4.9 in Breast Tumor Tissue Using RNA In Situ Hybridization
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人巨细胞病毒（HCMV）已被认为与多种癌症的肿瘤进展相关，但其在乳腺癌中的作用仍不明确。本研究利用RNAscope技术检测了三种乳腺癌亚型（ER+/PR+，n=25；HER2阳性，n=24；三阴性，n=26）及正常乳腺组织（n=5）中的人巨细胞病毒长链非编码R
人巨细胞病毒（HCMV）已被认为与多种癌症的肿瘤进展相关，但其在乳腺癌中的作用仍不明确。本研究利用RNAscope技术检测了三种乳腺癌亚型（ER+/PR+，n=25；HER2阳性，n=24；三阴性，n=26）及正常乳腺组织（n=5）中的人巨细胞病毒长链非编码RNA4.9（lncRNA4.9）。检测了血清HCMV IgG和IgM水平，并采用免疫组织化学方法评估乳腺组织中的泛巨噬细胞标志物CD68。HCMV IgG血清阳性率在ER+患者中更为常见，而IgM阳性率在HER2阳性和三阴性病例中更为频繁。在超过一半的肿瘤样本中检测到HCMV lncRNA4.9信号，定位于浸润性肿瘤细胞、基质细胞、脂肪组织及导管原位癌（DCIS）中。尽管各乳腺癌亚型之间的检出率无显著差异，但三阴性肿瘤表现出中至高水平lncRNA4.9表达。免疫组织化学分析显示，大多数肿瘤中存在CD68+细胞，且在HCMV lncRNA4.9阳性样本中更为丰富。这些细胞在浸润边缘与lncRNA4.9阳性细胞共定位，而在相关的DCIS病灶中，CD68+细胞存在于周围基质中。本研究首次证实乳腺组织中存在HCMV lncRNA4.9，支持HCMV在部分乳腺癌生物学中可能发挥的作用。
人巨细胞病毒（HCMV）与乳腺癌发生发展的关联：基于RNAscope的lncRNA4.9检测与肿瘤微环境分析
一、研究背景与目的
乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的主要原因。2022年全球新发病例约230万例，死亡病例约66.6万例。在新西兰奥特亚罗瓦（Aotearoa New Zealand），乳腺癌同样是女性最常见的癌症，约九分之一的女性一生中会罹患乳腺癌，每年新诊断3300例，死亡超过650例。尽管年龄、生殖激素和遗传易感性等风险因素已被确认，流行病学研究仍提示存在尚未被识别的重要风险因素。
全球每年超过15%的癌症（约220万例）归因于感染性病原体，其中近三分之二估计由病毒引起。人巨细胞病毒（HCMV）是一种人类β疱疹病毒，与所有疱疹病毒一样，可引起终身潜伏感染。成人HCMV血清阳性率为50%至100%，且随年龄增长而升高。HCMV可感染多种细胞类型，但对髓系谱系细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞）具有特殊趋向性。
1997年，Richardson提出部分乳腺癌可能由HCMV等常见病毒的晚期暴露所致。随后研究表明HCMV可能是结直肠癌和神经母细胞瘤的促成风险因素。然而，已发表研究的综述显示，多数证据支持HCMV与乳腺癌之间的因果关系，但关联既不一致也不强。近年来，Herbein及其同事提供了首个有力证据，证明HCMV可能作为致癌病毒参与乳腺癌。研究人员用HCMV临床分离株感染人乳腺上皮细胞，并将转化细胞注射入免疫缺陷小鼠乳腺脂肪垫，形成了三受体阴性（ER?/PR?/HER2?）肿瘤。重要的是，他们在转化细胞、小鼠异种移植瘤及人三阴性乳腺癌（TNBC）活检组织中检测到HCMV基因产物lncRNA4.9。lncRNA4.9是HCMV DNA复制的调节因子，在溶性和潜伏感染中均高表达，是检测HCMV的理想靶标。
鉴于既往研究多采用聚合酶链反应（PCR）检测HCMV基因产物，结果不一致，本研究采用RNAscope这一高灵敏度和特异性的RNA原位杂交技术，旨在检测福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的ER+/PR+、HER2过表达（HER2+）和TNBC乳腺癌样本肿瘤微环境中HCMV lncRNA4.9的表达水平和定位，并结合血清学检测和免疫组织化学分析，探讨HCMV在不同乳腺癌亚型中的潜在作用。
二、研究方法概要
本研究使用的样本来源于He Taonga Tapu癌症协会组织库（Cancer Society Tissue Bank Christchurch），共纳入75例早期（1-3期）乳腺癌女性患者的FFPE乳腺肿瘤样本和5例正常乳腺组织样本（来自乳腺缩小手术或BRCA1/2携带者的预防性切除）。研究队列进行了富集处理，使TNBC样本约占33%，高于乳腺癌患者人群中预期的10%至20%。主要技术方法包括：（1）采用酶联免疫吸附试验检测血清HCMV IgG和IgM抗体水平；（2）使用RNAscope 2.5 HD Assay—RED检测试剂盒对全切片FFPE组织进行HCMV lncRNA4.9原位杂交检测，并通过包含HCMV、EBV、HSV1、HSV2、SV40/多瘤病毒等感染细胞核心的对照阵列验证探针特异性；（3）采用免疫组织化学（IHC）方法检测泛巨噬细胞标志物CD68；（4）利用QuPath 0.3.2软件对RNAscope探针信号进行定量分析。所有研究人员在组织评估过程中对临床病理数据保持盲态。
三、研究结果
（一）研究队列特征
研究队列共80例（75例乳腺肿瘤，5例正常乳腺组织），76%（n=60乳腺肿瘤，n=1正常乳腺组织）的女性年龄超过50岁。75例肿瘤样本中，64例为3级，52例肿瘤大于21 mm。组织学亚型包括浸润性导管癌（n=73）和顶泌腺癌（n=2），大多数肿瘤表现为单一、局灶性病灶。
（二）血清学检测结果
HCMV IgG检测显示，43%的样本呈阳性（32例乳腺癌，1例正常），55%呈阴性，1例为临界值。HCMV IgM检测显示，41%的血清样本呈阳性（24例乳腺癌，2例正常），52%呈阴性，1例为临界值。
亚型分析显示，ER+/PR+乳腺癌女性的IgG血清阳性率最高（18/24，75%），显著高于HER2+组（9/22，41%）和TNBC组（5/25，20%）（卡方检验，p=0.0004）。相反，HCMV IgM血清阳性率在HER2+（10/19，53%）和TNBC（11/23，48%）中较高，而ER+/PR+组仅为17%（3/18）。这一结果表明，近期感染或再激活在HER2+和TNBC亚型中更为常见。
（三）RNAscope检测HCMV lncRNA4.9
对照阵列实验证实了HCMV lncRNA4.9靶探针的特异性：仅有HCMV感染细胞核心显示明亮的点状杂交信号，其他病毒（HSV1、HSV2、SV40/多瘤病毒、EBV）感染的细胞核心均无信号，阴性对照dapB探针无信号。
在80例乳腺组织样本中，47例（45例乳腺肿瘤，2例正常）显示HCMV lncRNA4.9靶探针杂交信号。HCMV lncRNA4.9信号分布于浸润性肿瘤组织（n=27）、乳腺导管（n=16）、脂肪组织（n=15）、基质（n=14）和DCIS病灶（n=13）。浸润性癌细胞较正常乳腺上皮细胞或DCIS细胞更可能有HCMV lncRNA4.9转录本（RR=1.68，95%CI：1.08-2.9，p=0.025）。两例正常乳腺组织阳性样本仅显示低水平信号（每张切片≤16个阳性细胞）。
乳腺癌各临床亚型间lncRNA4.9阳性样本数量无统计学差异（卡方检验，p=0.33）：ER+/PR+中18例阳性、7例阴性；HER2+中14例阳性、10例阴性；TNBC中13例阳性、13例阴性。然而值得注意的是，TNBC样本中显示中至高水平的HCMV lncRNA4.9表达比例更高：TNBC中38%（5/13）的阳性样本为高表达，而ER+/PR+和HER2+亚型中高表达分别仅占11%（2/18）和14%（2/14）。ER+/PR+和HER2+亚型中大多数（分别为72%和71%）的阳性样本为低表达水平。通过QuPath定量分析，各乳腺癌亚型之间每细胞lncRNA4.9转录本数量和探针信号簇数量均无显著差异。
（四）CD68免疫组织化学分析
CD68免疫组织化学染色在阳性对照组织（脾、肝、皮肤、阑尾）中显示一致的高强度染色，阴性对照和同型对照无染色。研究队列中仅2例样本无CD68染色（IHC评分=0），且均为HCMV lncRNA4.9阴性。5例正常乳腺组织和31例乳腺肿瘤样本获得1+评分（≤10%细胞染色），26例获得2+评分（10-30%细胞染色），16例获得3+评分（>30%细胞染色）。尽管HCMV lncRNA4.9阳性样本中高IHC评分（2-3+）数量是阴性样本的两倍，但差异未达统计学显著性（卡方检验，p=0.1305）。
（五）CD68与HCMV lncRNA4.9共定位分析
将连续切片的抗CD68免疫染色和RNAscope结果进行比对，发现共定位模式存在差异：在HCMV lncRNA4.9信号定位于DCIS的样本中，CD68+细胞出现在周围基质中而非与DCIS位点的lncRNA4.9信号共定位；同样，CD68染色未与lncRNA4.9阳性导管上皮细胞共定位，而是在周围基质中。然而，在孤立肿瘤细胞和浸润性肿瘤边缘区域，观察到大量CD68+细胞与HCMV lncRNA4.9阳性区域共定位。
四、结论
本研究首次利用RNAscope RNA原位杂交技术证明了HCMV lncRNA4.9阳性细胞存在于正常乳腺组织、DCIS和浸润性导管癌中，并可在乳腺肿瘤微环境中的多种细胞类型（上皮细胞、脂肪细胞和基质细胞）中检测到。尽管研究未提供充分证据支持HCMV晚期暴露导致部分乳腺癌的假说，但证明了HCMV lncRNA4.9在FFPE人乳腺组织样本中的广泛存在，并提示近期HCMV暴露可能在HER2+和TNBC亚型中更为常见。研究还观察到在浸润边缘处CD68+巨噬细胞与lncRNA4.9阳性细胞的共定位现象，提示HCMV感染的肿瘤相关巨噬细胞可能通过抑制免疫激活来调节乳腺肿瘤微环境。未来需要在大规模、特征明确的队列中进一步研究，以明确HCMV lncRNA4.9转录本的计数是否可作为部分乳腺癌亚型临床上实用且易于实施的预后标志物。该研究发表在《Journal of Histochemistry》。
