《Molecular Pain》：Intrathecal injection in MaFIA mouse model inflicts localized reduction of macrophage populations within the dorsal root ganglia
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巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，调节多种神经系统功能。先前研究强调了这一点，并确定了巨噬细胞在外周背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）中重要的躯体感觉作用。在几种临床前疼痛模型中，DRG巨噬细胞数量增加，但其起源缺乏证据。本研究
巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，调节多种神经系统功能。先前研究强调了这一点，并确定了巨噬细胞在外周背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）中重要的躯体感觉作用。在几种临床前疼痛模型中，DRG巨噬细胞数量增加，但其起源缺乏证据。本研究旨在利用创新性的巨噬细胞Fas诱导凋亡（Macrophage Fas-Induced Apoptosis, MaFIA）转基因小鼠模型研究该现象，并确立慢性间歇性缺氧模型中巨噬细胞扩增的来源。研究人员对MaFIA小鼠进行AP20187鞘内注射，利用AP20187的血脑屏障（blood brain barrier, BBB）不可渗透性，防止其暴露于全身组织，以确定敲低DRG组织驻留巨噬细胞是否会改变缺氧相关的DRG细胞数量倍增。局部AP20187暴露于中枢神经系统及邻近DRG结构后，脊髓和DRG等受限神经元组织中的巨噬细胞减少，而骨髓、循环血液和坐骨神经中的巨噬细胞群体不受影响。此外，经AP20187处理的MaFIA小鼠在慢性间歇性缺氧暴露后，DRG巨噬细胞数量未增加。这些研究结果表明，靶向鞘内给予AP20187可减少DRG组织驻留巨噬细胞，并阻止慢性间歇性缺氧诱导的先天免疫细胞群体扩增，从而排除了循环单核细胞在该现象中的作用。
鞘内注射AP20187在MaFIA小鼠模型中实现背根神经节巨噬细胞的局部清除：机制与应用解析
巨噬细胞作为先天免疫系统的核心成员，在维持组织稳态和调节神经系统功能中发挥关键作用。先前研究已证实，外周背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）中的巨噬细胞参与躯体感觉调控，并在神经病理性疼痛、炎症及缺氧等损伤条件下发生表型改变和数量增加。然而，关于DRG内巨噬细胞群体扩增的来源，学界一直存在争议：究竟是循环单核细胞浸润补充，还是组织驻留巨噬细胞原位增殖？这一问题的答案对于理解神经免疫互作机制及开发靶向疼痛疗法至关重要。MaFIA（Macrophage Fas-Induced Apoptosis）转基因小鼠模型是一种能够诱导性、可逆性清除巨噬细胞的工具，但其传统的全身性给药方式受限于血脑屏障（blood brain barrier, BBB）对AP20187的不可渗透性，难以选择性干预神经系统内的巨噬细胞群体。因此，研究者提出假设：通过鞘内注射途径将AP20187定向递送至脊髓和DRG区域，可实现神经系统局部巨噬细胞清除，同时保留循环系统中的巨噬细胞，从而为探究DRG巨噬细胞扩增来源提供精准手段。
研究人员采用MaFIA小鼠（C57BL/6-Tg(Csf1r-EGFP-NGFR/FKBP1A/TNFRSF6)2Bck/J，品系005070，购自Jackson Laboratory）作为实验对象，设计了一套连续5天、每日一次鞘内注射AP20187（2 μg/kg）的处理方案。该研究利用AP20187的BBB不可渗透特性，将药物作用限制在中枢神经系统及相邻的DRG结构内。实验主要涵盖以下关键技术方法：其一，鞘内注射技术的优化，以L4–L5椎间隙为穿刺点，通过尾尖甩动反应确认注射成功；其二，免疫荧光与免疫组织化学染色，使用F4/80、CD11b、Iba-1等标志物标记巨噬细胞或小胶质细胞，并用NeuN标记神经元、BAND3标记红细胞，以区分细胞类型；其三，流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）对DRG、脊髓、骨髓、血液和坐骨神经中的巨噬细胞进行定量分析；其四，慢性间歇性缺氧（chronic intermittent hypoxia, CIH）模型建立，即每日8小时暴露于8% O?环境，持续14天，以诱导DRG巨噬细胞扩增。所有动物实验均经德克萨斯大学圣安东尼奥分校（UTSA）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
研究结果分三个层面展开。第一，鞘内注射AP20187显著减少DRG和脊髓中的巨噬细胞。免疫荧光染色显示，AP处理组DRG和脊髓组织中F4/80阳性信号明显减弱，CD45标记的小胶质细胞（微胶质细胞）也相应减少，而神经元标志物NeuN染色未见明显变化，表明清除效应具有细胞类型特异性。流式细胞术进一步量化证实，AP处理组DRG中F4/80单阳性及CD11b单阳性细胞比例均显著下降（p<0.0001），F4/80/CD11b双阳性细胞也显著降低（p=0.0116）。第二，AP20187鞘内注射对全身巨噬细胞群体无显著影响。在骨髓、外周血和坐骨神经中，AP处理组与载体对照组相比，F4/80或CD11b阳性细胞比例均无统计学差异。脊髓组织流式分析显示，F4/80阳性细胞（p=0.0003）和CD45阳性细胞（p=0.0001）均显著降低，证实局部清除的靶向性。第三，AP20187预处理可完全阻断CIH诱导的DRG巨噬细胞扩增。在正常氧条件下，AP处理组与载体对照组DRG巨噬细胞数量无明显差异；但在CIH暴露14天后，载体对照组F4/80和CD11b阳性细胞比例显著上升，而AP处理组则维持在基线水平，且两因素方差分析显示交互作用显著（F4/80：p<0.0001；CD11b：p<0.0001）。这一结果直接表明，CIH诱导的DRG巨噬细胞增加并非源于外周循环单核细胞的浸润，而是组织驻留巨噬细胞的局部增殖。
讨论部分指出，由于DRG位于椎间孔的硬膜鞘内，直接药物注射需要部分切除椎骨，技术难度大。鞘内注射提供了一种微创且有效的替代方案，尤其适用于病毒载体递送和基因治疗等临床转化场景。本研究中，鞘内AP20187注射在腰段脊髓及相关L4–L6 DRG中成功实现巨噬细胞清除，且未引起可检测的全身效应。骨髄巨噬细胞群体的保留尤为重要，因为骨髓是外周单核/巨噬细胞的主要来源，若骨髓巨噬细胞也被清除，则会干扰对神经组织内巨噬细胞募集动态的分析。研究也存在局限性，例如仅评估了腰段区域，其他脊髓节段的清除效率尚不明确；但AP处理组与对照组之间显著的差异表明，注射位点可能引发的局部炎症反应并未对整体巨噬细胞数量变化产生实质性影响。
研究结论部分翻译如下：本研究证明，鞘内局部给予AP20187能够选择性清除脊髓和DRG组织中的巨噬细胞，同时保留全身巨噬细胞群体。通过利用MaFIA小鼠模型的关键特性，该方法为剖析外周神经系统中巨噬细胞的募集和功能提供了有力工具。这些发现建立了一种有效且微创的方法学框架，对未来研究局部疼痛通路的先天神经免疫调控具有广泛意义。该论文发表于《Molecular Pain》。
