内质网应激参与高剂量辐射诱导的慢性机械性和热性神经病理性疼痛

《Molecular Pain》：Endoplasmic reticulum stress contributes to high-dose radiation-induced chronic mechanical and thermal neuropathic pain

　　

高剂量辐射暴露可对人体造成严重伤害，并导致长期慢性疼痛。然而，辐射过度暴露引起疼痛的机制在很大程度上仍未知。本研究将小鼠双后爪和尾部暴露于40 Gy电子束以建立辐射诱导的疼痛模型。即使在受照射皮肤炎症消退后，小鼠仍表现出持续的机械性和热性疼痛。结果表明，在辐射后1个月，腰椎背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）中神经元损伤标志物激活转录因子3（activating transcription factor 3, ATF3）显著增加，神经元兴奋性显著升高。然而，常用镇痛药不能缓解辐射诱导的慢性疼痛。研究人员发现DRG中内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激被激活，腹腔注射ER应激拮抗剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid, 4-PBA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）可显著减轻机械性和热性痛觉超敏。此外，4-PBA和TUDCA降低了辐射引起的神经元过度兴奋。而且，4-PBA还改善了高剂量辐射诱导的运动功能障碍。该研究的发现强调了ER应激激活在高剂量辐射诱导的慢性神经病理性疼痛发展中的关键作用。此外，研究结果表明，靶向ER应激可能为预防高剂量辐射导致的慢性异常疼痛提供一种有前景的方法。

电离辐射在工业、医疗和军事等领域应用日益广泛，放射治疗（radiotherapy, RT）是多种恶性肿瘤的基础治疗手段，但也会对人体造成伤害。既往研究显示RT可诱导外周神经病理性疼痛，表现为机械性和热痛觉超敏。除RT相关损伤外，辐射过度暴露事故偶有发生，导致更严重的远期健康后果。例如，2014年一例极高剂量铱-192（¹⁹²Ir）暴露患者，尽管皮肤损伤愈合且肢体保留，在近5年随访中仍持续遭受局部疼痛，生活质量差。国际疼痛研究协会（International Association for the Study of Pain, IASP）将持续超过三个月的疼痛定义为慢性疼痛。然而，辐射过度暴露导致慢性疼痛的机制仍不清楚，也缺乏有效治疗痛觉超敏的方法。内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激已被证实是糖尿病神经病理性疼痛、多发性硬化、血管炎性周围神经病等疼痛状态的重要致病因素，但在辐射事故相关慢性疼痛中的作用鲜有研究。因此，研究人员构建了模拟辐射过度暴露事故的小鼠模型，旨在探究ER应激是否参与高剂量辐射诱导的慢性神经病理性疼痛，并评估ER应激拮抗剂的治疗潜力。该研究成果发表于《Molecular Pain》。

研究人员将成年ICR小鼠（22–25 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司）的双后爪和尾部暴露于40 Gy电子束（600 cGy/min）建立辐射诱导的疼痛模型。行为学测试采用Von Frey纤维丝检测机械性痛觉超敏，甩尾试验检测热痛觉超敏，丙酮刺激试验检测冷痛觉超敏。分子层面采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测背根神经节（DRG）及坐骨神经（sciatic nerve, SN）中ER应激相关分子表达；免疫荧光染色检测神经元损伤标志物ATF3及GRP78的定位；全细胞膜片钳技术记录DRG神经元兴奋性；高架十字迷宫（elevated plus maze, EPM）和转棒实验分别评估焦虑样行为和运动协调能力。药物干预中，ER应激拮抗剂4-PBA（40、100 mg/kg）和TUDCA（100、300 mg/kg）腹腔注射，吗啡、加巴喷丁和吲哚美辛作为常用镇痛药对照。

研究结果如下：

（1）高剂量辐射诱导小鼠慢性机械性和热性疼痛。辐射后皮肤出现肿胀、化脓、结痂，约4周基本愈合，H&E染色证实5周时炎症消退。然而，机械性痛觉超敏持续约5个月，热痛觉超敏从辐射后3天持续至第103天，冷痛觉超敏无显著变化。雌性小鼠同样表现机械和热痛阈降低，后续实验均在雄性小鼠中进行。这表明高剂量辐射可在皮肤恢复后引起长期机械性和热性痛觉超敏。

（2）高剂量辐射上调神经元损伤标志物表达。辐射后35天，DRG中ATF3免疫荧光信号显著增强，qRT-PCR显示Atf3、Cgrp、Gal、Vgf mRNA水平均显著上调，证明外周感觉神经元受损。

（3）高剂量辐射增加神经元兴奋性。全细胞膜片钳记录小DRG神经元（<25 μm）显示，辐射后神经元静息膜电位升高、基强度降低，100 pA电流诱发的动作电位数量增加，表明辐射增强DRG神经元兴奋性。

（4）高剂量辐射诱导的疼痛对常用镇痛药耐受。单次腹腔注射吗啡（5 mg/kg）或加巴喷丁（10 mg/kg）以及口服吲哚美辛（10 mg/kg）均不能缓解辐射诱导的机械和热痛，提示此类疼痛具有独特的难治性。

（5）高剂量辐射后DRG和SN中诱导ER应激。辐射后35天，DRG中GRP78、ATF4、CHOP、sXBP1的mRNA和蛋白水平显著升高，p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值增加。SN中CHOP表达增加，但其他ER应激蛋白水平降低，同时促凋亡蛋白Bax上调、抗凋亡蛋白Bcl2下调，提示SN因严重损伤和凋亡而出现蛋白表达下降。

（6）ER应激主要发生在CGRP神经元。免疫荧光双标显示，GRP78与CGRP（小直径肽能伤害性神经元标志物）、IB4（非肽能伤害性神经元标志物）和NF200（大直径有髓非伤害性神经元标志物）共定位，但不与胶质细胞标志物GS共定位；辐射后GRP78/CGRP双阳性细胞比例显著增加，而IB4和NF200阳性细胞中GRP78变化不明显，表明ER应激主要影响CGRP阳性伤害性神经元。

（7）ER应激抑制剂减轻高剂量辐射诱导的机械和热痛觉超敏。从辐射前1天开始每日腹腔注射4-PBA（40、100 mg/kg）和TUDCA（100、300 mg/kg）并持续两个月，二者均能剂量依赖性地减轻机械和热痛觉超敏，且效应在停药后仍观察一段时间。

（8）4-PBA和TUDCA降低高剂量辐射小鼠DRG中的ER应激。Western blot显示，4-PBA显著降低DRG中GRP78、ATF4、CHOP和sXBP1水平；TUDCA降低GRP78、ATF4和CHOP，但对sXBP1无显著影响。提示两者通过抑制DRG内ER应激发挥镇痛作用。

（9）抑制ER应激缓解高剂量辐射诱导的神经元兴奋性增加。4-PBA可逆转辐射引起的基强度降低，4-PBA和TUDCA均减少辐射后DRG神经元动作电位数量增加，但两者对静息膜电位无显著影响，表明抑制ER应激可降低辐射后的神经元过度兴奋。

（10）抑制ER应激缓解高剂量辐射诱导的慢性疼痛合并症。EPM测试显示辐射后小鼠开臂停留时间和进入次数无明显变化，说明未诱发焦虑样行为；转棒实验显示辐射后小鼠停留时间显著缩短，4-PBA治疗显著延长其运动时间，表明抑制ER应激可改善辐射导致的运动能力下降。

讨论部分指出，本研究表明高剂量辐射过度暴露可诱导持续机械和热痛觉超敏，DRG中ER应激标志物升高，ER应激拮抗剂能有效缓解疼痛行为。既往研究已将ER应激与多种神经病理性疼痛关联，但辐射过度暴露疼痛中的角色未被探索。该研究证明ER应激在感觉神经元中介导辐射相关疼痛中起关键作用。机制方面，ER应激可能通过影响钙稳态、下调GABAB受体等方式调节神经元兴奋性。常用的传统镇痛药对辐射诱导的神经病理性疼痛效果甚微，而4-PBA和TUDCA作为ER应激拮抗剂能降低DRG中的ER应激水平并缓解疼痛，提示这些药物有望成为治疗人类及伴侣动物辐射诱导慢性神经病理性疼痛的靶点。此外，慢性疼痛常伴随情绪和运动障碍，本研究中辐射未诱导焦虑行为，但导致运动能力下降，4-PBA可改善这一合并症。研究存在一定局限性：未在原代DRG神经元中阐明ER应激的确切机制，未探索离子通道功能变化，且仅研究了雄性小鼠。尽管如此，该研究证实ER应激促成了辐射诱导的神经病理性痛觉超敏，阻断ER应激可缓解痛觉超敏并减少异常神经元兴奋性。研究结论可概括为：该研究的结果强调了ER应激激活在高剂量辐射诱导的慢性神经病理性疼痛发展中的关键作用；此外，靶向ER应激可能为预防高剂量辐射导致的慢性异常疼痛提供一种有前景的方法。