单细胞转录组分析揭示骨关节炎软骨中表层区软骨细胞是分解代谢和衰老的焦点

《CARTILAGE》：Single-Cell Transcriptomic Profiling Reveals Superficial Zone Chondrocytes as a Catabolic and Senescent Focus in Osteoarthritis Cartilage

　　

目的：比较骨关节炎（osteoarthritis, OA）软骨中不同软骨细胞亚群的分解代谢蛋白酶和衰老相关基因的区域特异性表达模式。设计：分析了来自72,616个软骨细胞（11个人类软骨样本；6个正常，5个OA；GSE220243）的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据。经过质量控制和基于Harmony的批次校正后，细胞被聚类为27个亚群，并使用区域特异性基因集模块评分将其分配至表层（superficial zone, SZ）、中层（middle zone, MZ）、深层（deep zone, DZ）或钙化层（calcified zone, CZ）。对所有聚类进行了发育起源评分、分解代谢基因表达排序、衰老评分和信号通路分析。结果：区域分配后，MZ构成最大的区室（73.6%），其次是SZ（21.9%）和CZ（4.5%），没有聚类被赋予主要的DZ身份。MMP13和ADAMTS5在SZ聚类中显示出最高的每细胞表达，其中MMP13在FibroC-COL1A2⁺表层聚类（c10）中最突出。SZ软骨细胞携带组成性编码的成纤维细胞身份，转录组上类似于软骨膜和滑膜成纤维细胞程序，且与OA状态无关，同时相对于MZ存在Wnt抑制剂（FRZB、DKK1、WIF1）和FGF软骨保护信号传导的缺陷。在SZ和MZ的终末分化聚类中均观察到衰老，其中SZ中与mTOR和HIF1A信号传导相关的组成性易衰老微环境在机制上不同于MZ聚类中观察到的衰老程序。结论：这些发现将发育上独特的SZ确定为OA软骨中候选的分解代谢和衰老焦点，并可能成为基质降解的贡献者和区域分层治疗干预的靶点。

单细胞转录组揭示表层区软骨细胞是骨关节炎软骨的分解代谢和衰老焦点

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是全球最常见的关节疾病，影响超过5.9亿人，以关节软骨细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的进行性降解为核心病理特征。关节软骨在结构上分为四个区域：表层区（superficial zone, SZ）、中层区（middle zone, MZ）、深层区（deep zone, DZ）和钙化层（calcified zone, CZ），各区域软骨细胞具有不同的形态和分子程序。传统观点认为，深层肥大软骨细胞是MMP13、ADAMTS5等分解代谢蛋白酶及衰老相关因子的主要来源，但这一认识主要基于免疫组化蛋白检测，难以区分蛋白沉积位置与实际转录来源，且缺乏单细胞分辨率的区域系统性分析。因此，本研究利用公开的单细胞RNA测序数据集GSE220243（包含11例人类软骨样本，6例正常、5例OA；共72,616个软骨细胞），系统解析OA软骨中各区域软骨细胞亚群的分解代谢活性和衰老程序，旨在定位真正负责基质降解的细胞群体，并探索区域选择性治疗靶点。该研究发表于《CARTILAGE》期刊。

研究人员采用的主要技术方法包括：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）获取GSE220243的原始单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，使用Scanpy进行质量控制（每细胞检出基因数200–6000，线粒体基因比例<20%）、Scrublet去除双细胞、归一化及主成分分析，并通过Harmony算法校正供体批次效应，以Leiden聚类（分辨率2.0）将软骨细胞分为27个亚群。通过区域特异性基因集模块评分将每个细胞映射至SZ、MZ、DZ或CZ；利用扩散伪时间（diffusion pseudotime, DPT）轨迹分析、PAGA连通性分析、发育起源评分（软骨祖细胞、侧板中胚层、神经嵴、软骨膜、滑膜成纤维细胞）以及Wnt、FGF、衰老相关信号通路模块评分等方法，比较正常与OA状态下的差异。统计采用Mann-Whitney U检验和Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正。

研究结果分为以下五个部分。

第一，单细胞RNA测序鉴定出27个人类软骨细胞亚群。通过聚类分析，研究人员将软骨细胞注释为9大主要细胞类型：稳态软骨细胞（HomC）、氧化应激软骨细胞（RoSC）、基质重塑有害软骨细胞（MDC）、OA特异软骨细胞（OAC）、内质网应激软骨细胞（ERSC）、表层/PRG4阳性软骨细胞（SupC）、增殖软骨细胞（ProliC）、促炎软骨细胞（PIC）和纤维软骨细胞（FibroC），并进一步细分为27个亚群（c0–c26）。OA富集分析显示，c25（PIC-SPARC⁺/CLEC3A⁺）、c18、c9和c11在OA中名义上富集，但未通过FDR校正；c24（RoSC-ANGPTL4⁺/ERO1A⁺）和c21在OA中丰度降低。

第二，表层区软骨细胞是OA软骨中MMP13和ADAMTS5的主要转录来源。区域分配显示，MZ占73.6%，SZ占21.9%，CZ占4.5%，无亚群以DZ为优势身份。MMP13和ADAMTS5的每细胞平均表达在SZ亚群中最高，其中MMP13主要集中于c10（FibroC-COL1A2⁺），ADAMTS5在c9、c17、c15、c12中高表达。这提示OA中基质降解的转录活性在单细胞水平上主要集中于表层区，而非传统认为的深层肥大软骨细胞。

第三，SZ软骨细胞在发育上不同于MZ软骨细胞，与成纤维细胞起源相关。DPT分析显示SZ亚群的伪时间值低于MZ亚群，且正常与OA状态分布重叠，表明其身份是固有编码而非损伤诱导。发育起源评分显示，SZ亚群高表达软骨膜和滑膜成纤维细胞特征，而MZ亚群富含关节祖细胞特征。SZ亚群中COL1A1表达显著升高，并与软骨膜评分正相关，支持其成纤维细胞样发育起源。

第四，与MZ相比，SZ软骨细胞表现出较低的Wnt抑制剂和FGF信号。信号通路分析显示，SZ中Wnt抑制剂活性（FRZB、DKK1、WIF1）和FGF软骨保护信号均显著低于MZ，而Wnt靶基因（CCND1、COL1A1、COL1A2）和β-catenin信号升高，FGF受体表达也较低。这表明SZ存在固有的合成代谢保护缺失，使其更易发生分解代谢激活。

第五，终末分化的SZ亚群定义了与mTOR和HIF1A信号相关的易衰老生态位。衰老评分显示，c24（RoSC-ANGPTL4⁺/ERO1A⁺）在OA中衰老评分最高，SASP评分也最高。与MZ衰老亚群c5比较，c24在OA中癌基因诱导衰老（oncogene-induced senescence, OIS）评分更高，且富集mTOR和HIF1A信号；而c5的应激诱导衰老（stress-induced premature senescence, SIPS）评分升高，富集p38-MAPK和TGF-β信号。这说明SZ和MZ的衰老程序在机制上是不同的。

讨论部分指出，传统免疫组化在深层区检测到的MMP13、ADAMTS5蛋白信号可能反映分泌性蛋白酶从表层区扩散并沉积于深层基质，而非局部转录活性；SZ软骨细胞的成纤维细胞样发育起源、Wnt抑制和FGF保护的双重缺失，共同塑造了其固有的分解代谢易感性。研究结论：本研究提供了OA软骨高分辨率转录图谱，将SZ确立为分解代谢蛋白酶产生和衰老启动的候选核心区域。与主流观点相反，MMP13和ADAMTS5的表达主要富集于SZ驻留亚群；SZ软骨细胞共享成纤维细胞谱系特征，内在缺乏Wnt抑制和FGF保护，并含有由mTOR和HIF1A信号驱动的终末分化OIS生态位（c24），该生态位在机制上不同于MZ衰老亚群的SIPS程序。这些发现为OA发病机制提供了新的概念框架，但需通过空间转录组学、区域特异性功能干预和体内纵向模型进一步验证，方能实现其转化应用。