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时间顺序记忆（Temporal Order Memory, TOM）指依据事件发生先后区分事件的能力，是类情景记忆的关键组分，但其究竟反映时间标记本身还是竞争记忆痕迹间的相互作用尚存争议。阐明支持时间记忆的分子机制需能捕捉自然探索连续动态的行为学方法。尽管前额
时间顺序记忆（Temporal Order Memory, TOM）指依据事件发生先后区分事件的能力，是类情景记忆的关键组分，但其究竟反映时间标记本身还是竞争记忆痕迹间的相互作用尚存争议。阐明支持时间记忆的分子机制需能捕捉自然探索连续动态的行为学方法。尽管前额叶皮层（Prefrontal Cortex, PFC）参与时间记忆的证据充分，其支持时间顺序辨别的胞内信号机制仍不清楚。研究人员结合高分辨率自动化行为表型分析与分子分析表征小鼠TOM的行为与信号动态。小鼠接受自发物体识别TOM任务训练，在短程（3小时）或长程（24小时）保持间隔后测试。探索行为由基于人工智能的行为分析流水线量化，实现连续无偏的物体探索评估。在习惯化、单次训练或两次顺序训练后分析PFC与海马（Hippocampus, HIP）中ERK2磷酸化及ERK磷酸酶MKP3/DUSP6表达。另用时间新物体识别（Temporal Novel Object Recognition, TeNOR）协议评估记忆痕迹完整性。小鼠在各性别与保持间隔下均表现稳健TOM。分子分析显示海马ERK信号无显著变化，而PFC胞质分数呈现经验依赖的ERK2磷酸化动态调制：单次15分钟训练诱导ERK2激活短暂升高，45分钟后第二次训练伴随该升高减弱，同时MKP3表达增加，符合主动调节反馈机制招募。连续行为追踪揭示常规汇总指标未捕获的记忆表达时间特征，TeNOR中识别旧物体记忆的早期快速衰退提示TOM依赖共存记忆痕迹间竞争提取的消解。综上，研究揭示PFC早期动态ERK2-MKP3信号与时间辨别相关，并证明自然行为范式高分辨率表型分析可揭示经验时间组织的分子动态。
研究背景与问题提出：类情景记忆要求不仅再认过往事件，还需编码其时间关系。啮齿类时间顺序记忆（Temporal Order Memory, TOM）范式通过分辨不同时刻接触的熟悉物体评估时间辨别，但测试中偏好“较老”物体究竟源于真实时间判别，还是竞争提取与倒摄干扰的涌现属性尚未解决。自发物体识别范式虽生态相关，但探索行为连续动态使传统人工评分受限。前额叶皮层（Prefrontal Cortex, PFC）支持时序信息组织，海马（Hippocampus, HIP）整合“何物-何处-何时”，然PFC内胞内信号机制不明。细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK1/2）通路是突触可塑性与长时记忆核心调节器，其激活幅度受磷酸酶MKP3/DUSP6负调，但MKP3在TOM中作用未涉。本研究由此开展。
主要技术方法：研究使用107只8–9周龄C57BL/6小鼠（雌雄均有，分多队列）。行为上采用两训练期（TR1、TR2间隔45分钟）TOM协议及变式TeNOR，测试短程3小时与长程24小时保持。探索行为经Genius ECAM-8000记录，DeepLabCut（ResNet-50）姿态估计提取鼻、头、颈等坐标，由RAINSTORM流水线（基于人工神经网络的行为分类）帧级量化物体探索与辨别指数（Discrimination Index, DI）。分子上于习惯化、TR1或TR2后0、1、2小时断头取PFC与HIP，分离胞质与核富集组分，Western blot检测磷酸化ERK2（pERK2）、总ERK2及MKP3，以Ponceau红染总蛋白归一。统计用R以Beta回归（行为DI）与Gamma回归（分子比值）拟合广义线性混合效应模型。
研究结果：
3.1 时间顺序记忆形成的行表征：研究人员于2月与3月龄小鼠评短程（3小时）与长程（24小时）TOM。RAINSTORM量化显示雌雄在各年龄与间隔下DI均显著高于机遇0.5，即稳定偏好TR1旧物体；3月龄雌鼠长程测试总探索时间偏高。2月龄独立队列长程TOM同样显著。连续DI曲线显示测试早期即渐现时间辨别，累积探索曲线训练期无位置偏好、测试期偏向旧物体。
3.2 TOM期间ERK2磷酸化动态：PFC与HIP胞质/核分数分析聚焦ERK2（42 kDa）。海马无显著变化。PFC胞质Gamma回归示训练条件×时间交互显著：TR1后1小时pERK2/总ERK2比升至高于习惯化基线，TR1后0小时不变；TR2后1小时该升高被抑制至基线水平，但TR2后2小时出现延迟性升高。核分数呈相似交互。总ERK2量不变。
3.2.1 训练诱导PFC中MKP3表达调制：胞质MKP3/Ponceau比示训练×时间交互显著。TR2后1小时MKP3较习惯化基线及TR1后1小时均升高，其余时点稳。
3.2.2 经验依赖的ERK磷酸化与MKP3表达时间耦合：Pearson相关按组分段。TR1后0小时pERK2与MKP3正关（R=0.689），提示新异刺激下激酶与磷酸酶并行动员；TR2后2小时转负相关（R=-0.773），符合重复训练招募负反馈。习惯化组无关联。
3.2.3 探索时间预测MKP3响应幅度而非ERK激活：探索时长与pERK2无关；TR1后1小时探索时间与MKP3负关（R=-0.808），即探索越久1小时后MKP3越低，暗示MKP3按行为强度缩放信号窗。
3.3 TeNOR揭示差异记忆痕迹：TeNOR于24小时后测，分组看TR1旧物体+新物体（PriorTR）或TR2近物体+新物体（LatterTR）。连续DI示LatterTR组全程强偏好新物体（高于机遇14.2%），PriorTR组全程无辨别（0.5%）；但测试首约1分钟两组均暂偏好新物体（PriorTR组高17.5%），说明TR1痕迹初期可及而后迅速让位于竞争。
讨论总结：研究认为TOM偏好老物体可能非严格时间戳，而是时间邻近痕迹竞争提取与相对稳定性差异的行为读出，PFC调控竞争记忆表征互动。ERK2在PFC的单次训练后1小时峰值被45分钟后二次训练抑制、伴MKP3延迟上调，与果蝇及蟹中ERK重置防止分子重叠的发现呼应，构成顺序学习早期信号签名。MKP3在TR1后0小时与pERK2正关或由已存mRNA快速翻译启动（ERK磷酸化4E-BP1促翻译），TR2后2小时转负关标志负反馈确立；探索时长负调MKP3提示信号窗按经验强度缩放。TeNOR首分钟旧痕可及支持倒摄干扰框架。局限为全组织提取未分神经元亚型，因果需药理/基因干预。
结论翻译：综上，本研究支持如下假设——小鼠时间顺序记忆至少部分依赖前额叶皮层调控物体识别记忆痕迹间互动的机制。ERK2的协调激活及其快速经验依赖下调，连同MKP3表达增加，界定了与竞争记忆痕迹消解相关的分子签名。未来需因果性操控以确定该信号是否直接调节时间辨别或相关记忆干扰形式。论文发表于《Frontiers in Molecular Neuroscience》。
