多巴胺包覆聚己内酯纳米球用于腐霉利递送以提高抗真菌活性和环境安全性

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Dopamine coated polycaprolactone nanospheres for prochloraz delivery to improve antifungal activity and environmental safety

　　摘要由于防治效果差且毒性过高，杀菌剂在农业领域的使用呈现受限趋势。因此，开发新型抗真菌活性成分递送系统以提高生物活性和环境安全性具有广阔前景。具有优良粘附性的杀菌剂配方是一种提高润湿性和生物利用率的有效策略。本研究旨在阐明多巴胺（DA）包覆丙环唑（Pro）-聚己内酯（PCL）纳米球在提高抗真菌活性和环境安全性方面的协同机制。除提高润湿性和抗光降解能力外，DA中的酚羟基还使Pro-PCL-DA纳米球能够降低突释速率并延长释放持续时间。Pro-PCL-DA纳米球对尖孢镰刀菌表现出优异的抗真菌活性。该活性主要归因于其较强的跨膜转运能力、诱导过量活性氧以及增强膜通透性。环境安全性试验表明，Pro-PCL-DA纳米球可有效降低Pro对成年斑马鱼和赤子爱胜蚓的急性毒性。总体而言，这些结果表明白氨酸包覆Pro-PCL纳米球是一条潜在途径，可为提高杀菌剂利用效率、促进农业长期可持续发展提供有力平台。引言杀菌剂是保障作物品质、防止病害侵蚀的主要农药[1]、[2]、[3]。鉴于其能抑制细胞色素P450依赖的14α-去甲基酶活性及麦角固醇生物合成，三唑类杀菌剂丙环唑（Pro）在园艺和农业领域被广泛用于防治真菌病害[4]、[5]、[6]。除抑制麦角固醇生物合成外，Pro的另一抗真菌机制即诱导过量活性氧（ROS）以及影响雄激素调节基因表达，也一直备受关注[7]、[8]、[9]。由于水溶性差且不稳定，Pro的利用效率低下，由此引发了一系列环境问题和健康风险[10]。因此，开发新型Pro递送系统以提高生物活性和安全性是一项很有前景的工作。综合考虑效率、安全性和实用性，纳米农药被国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）列为十大新兴技术之首[11]、[12]。目前，纳米农药递送系统的可生物降解聚合物基体是作物保护领域的研究热点[13]、[14]、[15]。聚己内酯（PCL）因其优良的生物相容性、出色的可生物降解性和高渗透性，在医疗器械、组织工程补充材料及药物递送系统等多样化医疗应用中备受关注[16]、[17]、[18]、[19]。近年来，Pro纳米递送系统的研究主要集中在介孔二氧化硅纳米颗粒[20]、乙基纤维素纳米颗粒[9]、介孔钼化硒[21]和金属-有机框架[22]等方面。基于缓慢降解特性和遮光屏障作用，PCL聚合物基体适合作为载体材料实现长效递送并增强抗光降解能力。然而，关于PCL纳米球负载Pro的研究相对有限。因此，探索创新的PCL纳米球负载Pro抗真菌配方以提高抗真菌活性是一项迫切任务。如今，仿生粘附化合物表面修饰在材料科学和工程学尤其是智能药物递送系统的高级材料开发中发挥着卓越作用[23]、[24]、[25]。由于其具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌等特性，贻贝仿生成分多巴胺（DA）在食品、医药和化妆品领域备受关注[26]、[27]。DA富含儿茶酚基团和氨基，能够在弱碱性环境中自发氧化聚合为聚多巴胺，沉积于有机和无机材料表面形成智能包覆层[28]、[29]。基于其优异的基材结合能力，多巴胺自聚合涂层已被广泛应用于生物材料的表面修饰以提高粘附性和润湿性[30]、[31]。因此，将Pro-PCL纳米球与强粘附性贻贝DA结合以开发智能长效缓释农药递送系统具有高度可行性。本研究旨在阐明DA包覆Pro-PCL纳米球在提高抗真菌活性和环境安全性方面的协同机制。本研究中，采用溶剂蒸发法制备DA包覆Pro-PCL纳米球。采用动态光散射法（DLS）测定聚己内酯纳米球的流体动力学粒径和Zeta电位。采用透射电子显微镜（TEM）观察聚己内酯纳米球的形貌。考察聚己内酯纳米球的释放行为、光降解和润湿性。通过测定尖孢镰刀菌菌丝生长抑制率，确定聚己内酯纳米球的半最大有效浓度（EC50）值。检测跨膜转运、活性氧、膜电位和麦角固醇以阐明DA包覆Pro-PCL纳米球提高抗真菌活性的协同机制。此外，还考察了Pro纳米球对非靶标生物的生物学安全性。本研究为可持续农业领域提供了一类抗真菌有效且环境安全的纳米球平台。材料丙环唑（≥98%）、罗丹明123、聚乙烯醇（PVA，醇解度87.0-89.0 mol%，粘度3.2-3.6 mPa·s）、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和乙醇购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。多巴胺盐酸盐（≥98%）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、罗丹明6G、四氢呋喃（THF）、二氯甲烷（DCM）和聚己内酯（Mn 45000）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。聚己内酯纳米球的表征采用油包水（o/w）溶剂蒸发法制备负载Pro的PCL-DA纳米球。如图2所示，DLS测得Pro-PCL和Pro-PCL-DA纳米球的流体动力学强度平均粒径分别为186.47 nm和206.57 nm。与未改性的Pro-PCL纳米球相比，Pro-PCL-DA纳米球的流体动力学强度平均粒径增加了10.78%，这主要归因于包覆在Pro-PCL表面的DA表层。结论为阐明Pro-PCL-DA纳米球优异的抗真菌活性，制备了DA包覆Pro-PCL纳米球。由于外部包覆的DA层，Pro-PCL-DA纳米球的平均粒径大于未改性Pro-PCL纳米球，呈现近乎规则的球形结构。由于DA中含有丰富的酚羟基，Pro-PCL-DA纳米球的Zeta电位显著低于未改性Pro-PCL纳米球。CRediT作者贡献声明Qingshan Shi（施青山）：监督、项目管理、形式分析、数据整理。Jingxia Liu（刘京霞）：可视化、方法学、形式分析。Jin Feng（冯金）：方法学、调查、数据整理。Ping Yang（杨平）：可视化、形式分析、数据整理。Qian Wang（王倩）：写作–审阅与编辑、方法学、数据整理。Chunxin Wang（王春心）：方法学、资金获取、形式分析。Hong Qi（齐红）：调查、资金获取、形式分析、数据整理。Manli Yu（俞蔓丽）：写作–审阅与编辑。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。致谢本研究由国家自然科学基金（52301083）、国家重点研发计划（2022YFD1700500）和广东省科技计划项目（2023B0202080002）资助。（作者）Junwei Yao、Qian Wang、Chunxin Wang、Hong Qi、Qingshan Shi、Jingxia Liu、Jin Feng、Ping Yang、Manli Yu、Xiaobao Xie（单位）华南应用微生物国家重点实验室、广东省微生物菌种保藏与应用重点实验室、广东省科学院微生物研究所，中国广州 510070