《Clinical and Translational Medicine》：NSUN4-dependent m5C modification facilitates mitochondrial fission to accelerate diabetic nephropathy process via regulating SMURF1/CAMK1 axis
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背景：NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员4（NSUN4）介导的5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰已涉及糖尿病相关疾病，但其在糖尿病肾病（DN）中的作用及分子机制尚不清楚。方法：研究人员通过链脲佐菌素（STZ）注射构建DN小鼠模型，以高糖（HG）诱导HK-2细
背景：NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员4（NSUN4）介导的5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰已涉及糖尿病相关疾病，但其在糖尿病肾病（DN）中的作用及分子机制尚不清楚。方法：研究人员通过链脲佐菌素（STZ）注射构建DN小鼠模型，以高糖（HG）诱导HK-2细胞建立细胞模型，采用qRT-PCR、蛋白质印迹（WB）、免疫组化检测NSUN4、SMAD泛素化调节因子1（SMURF1）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶1（CAMK1）及线粒体相关蛋白水平；通过相关试剂盒和组织学染色评估小鼠肾损伤；TUNEL、二氢乙锭（DHE）、MitoSOX Red及EdU染色检测细胞凋亡、活性氧（ROS）产生与增殖；RNA免疫沉淀（RIP）、免疫共沉淀（Co-IP）及泛素化实验验证SMURF1与Aly/REF输出因子（ALYREF）或CAMK1互作。结果：DN中NSUN4上调使m5C水平升高；敲除NSUN4通过抑制肾小管细胞线粒体分裂、促进融合减轻STZ诱导的小鼠肾损伤；下调NSUN4减少HG诱导HK-2细胞线粒体分裂并缓解凋亡。NSUN4介导的m5C修饰经ALYREF调控SMURF1 mRNA稳定性；SMURF1过表达逆转NSUN4敲低对细胞线粒体分裂与凋亡的抑制；SMURF1促进CAMK1泛素化降解；sh-CAMK1消除sh-SMURF1对分裂与凋亡的抑制。NSUN4下调经SMURF1/CAMK1轴减少线粒体分裂缓解DN小鼠肾损伤。结论：NSUN4介导的SMURF1上调通过增加CAMK1泛素化促进线粒体分裂，加速DN进展，NSUN4/SMURF1/CAMK1轴为DN发病机制提供新见解。
研究背景方面，过去20年糖尿病及其并发症发病率上升，约30%–40%糖尿病患者发展为糖尿病肾病（DN），肾小管损伤是DN早期特征，与近端肾小管上皮细胞线粒体功能障碍有关，线粒体融合与分裂失衡密切参与DN发生。目前m5C（5-甲基胞嘧啶）作为真核生物RNA常见转录后修饰，其写入蛋白NSUN4存在于线粒体且表达异常影响线粒体功能，已在糖尿病视网膜病变中见上调，但NSUN4是否经m5C修饰调控线粒体动力学参与DN未知；E3泛素连接酶SMAD泛素化调节因子1（SMURF1）在DN中可减轻肾损伤且与线粒体凋亡相关，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶1（CAMK1）低表达可抑制线粒体分裂缓解DN，软件预测SMURF1为CAMK1泛素化连接酶，但NSUN4经SMURF1/CAMK1轴介导线粒体动力学影响DN尚未阐明，故研究人员开展本研究。研究人员通过临床样本、动物模型与细胞模型结合多组学及生化手段，得出NSUN4依赖m5C修饰经ALYREF稳定SMURF1 mRNA，SMURF1泛素化降解CAMK1，从而促进肾小管线粒体分裂、加重凋亡与肾损伤的结论；该发现揭示表观转录组与泛素化降解协同调控线粒体形态的新机制，为DN提供NSUN4/SMURF1/CAMK1潜在治疗靶点，论文发表于《Clinical and Translational Medicine》。
关键技术方法概括：研究人员收集中南大学湘雅二医院10例DN患者与10例轻度肾小球病变者肾组织临床队列；构建STZ诱导C57BL/6小鼠DN模型及肾小管特异性NSUN4条件敲除（cKO）小鼠，并辅以db/db遗传模型；以30 mM D-葡萄糖处理HK-2细胞建立高糖模型。主要技术包括LC-MS/MS与dot blot定量m5C水平，MeRIP（甲基化RNA免疫沉淀）与RNA pull-down判定m5C读取蛋白ALYREF结合，RIP与Co-IP验证RNA-蛋白及蛋白-蛋白互作，放线菌素D（Act D）与环己酰亚胺（CHX）追踪mRNA与蛋白稳定性，HA-Ub泛素化实验证明SMURF1对CAMK1的蛋白酶体降解，以及TEM、JC-1、MitoSOX Red评估线粒体形态与膜电位。
研究结果如下。3.1节NSUN4高表达提升DN中m5C水平：研究人员经LC-MS/MS、dot blot及qRT-PCR在患者、STZ小鼠、db/db小鼠及HG-HK-2细胞中均见m5C与NSUN4（NOP2/Sun RNA甲基转移酶4）上调，七种m5C写入蛋白中以NSUN4最显著，过表达NSUN4升m5C、敲低则降m5C。3.2节NSUN4-cKO缓解DN小鼠肾损伤：肾小管特异性敲除NSUN4后，STZ小鼠体重回升、血糖及BUN、Cre、U-NAG、ACR降低，H&E与PAS评分改善，TUNEL与DHE阳性减少，ATP回升，TEM示线粒体片段化下降、长宽比恢复，融合蛋白Mfn1/Mfn2升、分裂蛋白Fis1与p-Drp1 Ser616/Drp1降。3.3节敲低NSUN4抑制HG-HK-2细胞线粒体分裂与凋亡：sh-NSUN4降分裂标志、升融合标志，JC-1红绿比恢复、mtROS降、ATP升、EdU增、TUNEL减。3.4节NSUN4/ALYREF促进SMURF1 m5C修饰：MeRIP示HG增SMURF1 m5C且被sh-NSUN4逆转；RNA pull-down证ALYREF偏嗜m5C，RIPSeq与RIP证ALYREF结合SMURF1 mRNA；NSUN4通过ALYREF提升SMURF1 mRNA稳定性，患者肾中NSUN4与SMURF1正相关。3.5节SMURF1过表达逆转sh-NSUN4效应：pc-SMURF1回补使Mfn1/2降、Fis1/p-Drp1升，并逆转JC-1、mtROS、ATP、EdU、TUNEL变化。3.6节SMURF1促进CAMK1泛素化降解：UbiBrowser预测及Co-IP证互作，过表达SMURF1降CAMK1蛋白不降mRNA，HA-Ub实验证泛素化增强，CHX示稳定性降，患者中SMURF1与CAMK1负相关。3.7节SMURF1敲低经升CAMK1抑分裂：sh-SMURF1效应当被sh-CAMK1消除，证实SMURF1下行CAMK1促分裂凋亡。3.8节体内NSUN4经SMURF1/CAMK1轴致伤：肾内注射sh-NSUN4降NSUN4/SMURF1、升CAMK1并改善肾功能与线粒体形态，追加sh-CAMK1取消保护。
讨论部分总结：研究人员指出DN肾小管线粒体功能障碍是核心，NSUN4作为线粒体型m5C写入器在糖尿病并发症中首见肾内上调；NSUN4经ALYREF读码器稳定SMURF1 mRNA，有别于既往IGF2BP3经m6A稳CAMK1之路径，本文明示SMURF1作E3连接酶直接泛素化CAMK1蛋白降解，从而解除CAMK1对Drp1介导分裂的抑制。局限包括未定位SMURF1 mRNA具体m5C位点、临床样本量小、未同时测PINK1/Parkin线粒体自噬与PGC-1α生成、NSUN4-cKO改善体重血糖属肾内抑或代谢间接效未分、常规免疫荧光难区分胞质与线粒体内NSUN4。结论部分翻译：总体而言，本研究揭示NSUN4促进线粒体分裂以加速DN诱导的肾损伤及HG诱导的肾上皮细胞凋亡，其机制可能为促进SMURF1的m5C修饰进而加速CAMK1泛素化降解；NSUN4/SMURF1/CAMK1轴的提出为线粒体动力学介导DN进展提供新证据，并为DN治疗提供潜在分子靶点。
