《Clinical and Translational Medicine》：PRAME promotes invasion and metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma by regulating RARα stability via the cullin2 ubiquitin-proteasome system
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背景：全反式维甲酸(ATRA)主要通过核受体发挥其生物学功能，但其在实体瘤中的治疗效果仍然有限。本研究旨在阐明癌-睾丸抗原PRAME在ATRA受体RARα翻译后修饰(PTM)中的调控作用，并评估其对涎腺腺样囊性癌(SACC)肿瘤进展的影响。
方法：研究人员对
背景：全反式维甲酸(ATRA)主要通过核受体发挥其生物学功能，但其在实体瘤中的治疗效果仍然有限。本研究旨在阐明癌-睾丸抗原PRAME在ATRA受体RARα翻译后修饰(PTM)中的调控作用，并评估其对涎腺腺样囊性癌(SACC)肿瘤进展的影响。
方法：研究人员对来自基因表达综合数据库(GEO)的公共数据集和临床组织样本进行转录组测序，以鉴定重叠的差异表达基因。利用TCGA数据库分析PRAME在人类泛癌中的表达模式及其与总生存期的相关性。开展了细胞转录组测序、细胞功能实验、免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白质印迹、蛋白质稳定性实验、裸鼠异种移植瘤和肺转移模型以及生物信息学分析，以研究PRAME通过降解RARα和调控EMT通路促进SACC转移的潜在调控机制。
结果：研究人员发现PRAME在33种常见人类肿瘤类型中高表达，在正常组织中表达极低，其上调与不良预后相关。在SACC临床标本和细胞系中，PRAME表达显著升高。功能上，PRAME上调Twist1表达并促进上皮-间质转化，从而增强SACC细胞的侵袭和转移能力。在体内，PRAME沉默减弱了皮下肿瘤发生和肺转移。机制上，PRAME与Cullin2泛素连接酶复合物结合，使RARα蛋白不稳定并促进上皮-间质转化(EMT)。
结论：总之，研究人员的发现揭示了PRAME通过Cullin2泛素-蛋白酶体途径加速RARα降解，同时诱导Twist1介导的EMT，从而驱动SACC转移。这些结果将PRAME定位为SACC的候选生物标志物和可行的治疗靶点。
关键要点：
- 在涎腺腺样囊性癌(SACC)中，PRAME通过上调Twist1和诱导上皮-间质转化驱动肿瘤细胞侵袭和转移。
- PRAME与Cullin2泛素连接酶结合使RARα不稳定，揭示了一种可能限制SACC中ATRA反应性的翻译后机制。
- PRAME在体内促进皮下肿瘤生长和肺转移，巩固了其作为SACC关键致癌驱动因子的作用。
涎腺腺样囊性癌(SACC)是一种具有独特临床病理特征的恶性肿瘤，约占所有涎腺肿瘤的10%及头颈部癌的3%–5%，好发于50–60岁人群，女性略多见。SACC生长缓慢但侵袭性强，常表现为神经周围侵袭和强烈的远处转移倾向，尤其易转移至肺部(占40%–50%的病例)。虽然手术联合放疗可有效控制局部病变，但长期预后仍不理想，20年生存率低于30%，主要原因是远处转移难以控制。近年来针对NOTCH和c-KIT通路以及免疫检查点抑制剂的临床试验总体缓解率较低。全反式维甲酸(ATRA)已被证明可抑制MYB活性，其生物学功能主要依赖于维甲酸受体(RAR-α、RAR-β、RAR-γ)和维甲酸X受体(RXR)形成的异二聚体，其中RARα是关键亚型。然而，ATRA在包括SACC在内的实体瘤中的疗效仍然有限。因此，本研究旨在阐明癌-睾丸抗原PRAME在ATRA受体RARα翻译后修饰(PTM)中的调控作用，并评估其对SACC肿瘤进展的影响。该研究发表在《Clinical and Translational Medicine》。
研究人员从基因表达综合数据库(GEO)(GSE59701和GSE88804数据集)以及北京同仁医院临床组织样本(25例原发肿瘤、34例肺转移灶及12例正常组织)中进行转录组测序并鉴定重叠的差异表达基因；利用TCGA数据库进行泛癌表达及预后分析；采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白质印迹、环己酰亚胺(CHX)追踪实验、免疫荧光(IF)、免疫组织化学(IHC)等方法验证蛋白互作与稳定性；构建稳定转染细胞系并通过裸鼠皮下异种移植瘤和尾静脉肺转移模型进行体内验证；结合STRING数据库蛋白互作分析、HDOCK分子对接和基因集富集分析(GSEA)进行生物信息学预测。
研究结果：
PRAME在SACC和泛癌中高表达并与不良预后相关：通过GEO数据集分析，在GSE59701(12例肿瘤和12例正常样本)中鉴定出484个上调基因和598个下调基因，在GSE88804(7例肿瘤和7例正常样本)中鉴定出688个上调基因和1037个下调基因。泛癌分析显示PRAME在33种主要肿瘤类型中广泛过表达，在正常组织中几乎不表达。TCGA数据的Kaplan-Meier分析证实PRAME高表达与较差的总生存期显著相关。临床队列转录组测序显示PRAME表达从正常组织到原发肿瘤和肺转移灶呈阶梯式升高，IHC染色也证实原发肿瘤和肺转移灶中PRAME蛋白水平显著高于癌旁正常组织。
PRAME促进SACC细胞的迁移和侵袭：研究人员构建了稳定过表达或敲低PRAME的SACC-83和SACC-LM细胞系。转录组测序鉴定出589个上调基因和807个下调基因。GSEA富集分析显示PRAME具有抑制坏死性凋亡和驱动间充质细胞行为(包括增殖、迁移和EMT)的双重作用。划痕愈合实验和Transwell实验证实PRAME增强SACC细胞的迁移和侵袭能力，鬼笔环肽染色显示PRAME促进丝状伪足的形成。
PRAME与RARα相互作用并下调其蛋白表达：转录组测序显示PRAME与RARα在mRNA水平无显著相关性，但STRING数据库预测二者存在蛋白水平相互作用。泛素化数据库挖掘将RBX1确定为RARα的候选E3连接酶。免疫荧光显示PRAME和RARα在SACC细胞中共定位，分子对接显示RARα-PRAME和RARα-Cullin2的对接分数分别为-236.53和-237.26，表明相互作用稳定。内源性Co-IP结合蛋白质印迹证实RARα与Cullin2、PRAME、RBX1和ELOB相互作用。siRNA敲低Cullin2、ELOB和RBX1均显著增加RARα蛋白表达，MLN4924处理也导致RARα积累。
PRAME通过Cullin2-蛋白酶体系统介导RARα的泛素化和降解：CHX追踪实验显示PRAME敲低组RARα蛋白半衰期延长，敲低Cullin2、ELOB和RBX1同样延长了RARα的半衰期。Co-IP实验表明沉默这些复合物组分抑制RARα的多聚泛素化。K48和K63特异性泛素抗体评估显示MG132抑制泛素介导的RARα降解，且以K48连接泛素化为主。这些结果表明PRAME-RBX1-Cullin2-ELOB复合物与RARα结合并介导其泛素化和随后的蛋白酶体降解。
PRAME在体内通过调控RARα和EMT通路促进肿瘤形成和肺转移：裸鼠皮下异种移植实验显示PRAME敲低显著抑制肿瘤生长，肿瘤体积和重量均显著降低。IHC染色显示PRAME敲低肿瘤中RARα蛋白表达上调。尾静脉注射实验表明PRAME敲低降低了肺转移的发生率。RNA-seq显示PRAME敲低显著降低Twist1和Snail1的mRNA表达水平。蛋白质印迹显示Twist1、N-cadherin和Vimentin下调，而E-cadherin上调，PRAME过表达可恢复EMT表型。
PRAME通过Cullin2和RARα促进SACC细胞的侵袭和迁移：在过表达PRAME的细胞中瞬时敲低Cullin2可恢复RARα蛋白表达。Transwell实验显示PRAME过表达增加SACC细胞侵袭和迁移能力，而Cullin2敲低可挽救这一表型。在sh-PRAME细胞中敲除RARA可恢复细胞迁移能力，表明PRAME通过Cullin2和RARα促进SACC细胞迁移。
讨论与结论：目前SACC复发或转移性疾病的全身治疗选择非常有限。PRAME作为原型癌-睾丸抗原(CTA)，在多种恶性肿瘤中上调，其表达水平与肿瘤侵袭性和不良预后相关。本研究发现PRAME通过Cullin2泛素-蛋白酶体系统负性调控RARα蛋白稳定性，这可能解释了ATRA在SACC中疗效有限的潜在机制。同时，PRAME通过上调Twist和Snail促进EMT。该研究存在一些局限性，如SACC病程惰性、需要更大样本量和更长随访时间来确定PRAME表达与生存期相关性，以及目前缺乏PRAME特异性抑制剂。总之，该研究揭示了PRAME–Cullin2–RARα轴驱动SACC的EMT和转移，为ATRA耐药提供了新的翻译后调控机制解释，将PRAME定位为SACC的候选生物标志物和可行的治疗靶点。
