壳聚糖-岩藻多糖纳米颗粒增强针对咖啡豆象脂肪酸合酶的RNA干扰

《Journal of Stored Products Research》：Chitosan-fucoidan nanoparticles enhance RNA interference targeting fatty acid synthase in Callosobruchus maculatus

　　

RNA干扰（RNAi）在害虫防治方面展现出巨大的潜力。然而，RNAi技术在害虫防治中的实际应用仍面临诸多挑战，例如靶基因选择、双链RNA（dsRNA）降解以及RNAi效率低下等问题。本研究以豆象（Callosobruchus maculatus）为模式生物，选择编码脂肪酸合酶（FASN）的基因作为昆虫防治的靶标。通过RACE技术扩增CmFASN基因全长序列后，对其基因结构和表达模式进行了分析，结果显示该基因具有较高的保守序列结构以及时空表达特征。随后，采用离子凝胶法以壳聚糖、岩藻多糖和dsFASN合成了dsFASN-CS-FCN纳米颗粒。dsFASN-CS-FCN纳米颗粒表现出优异的分散性、增强的体外稳定性和较高的RNAi效率。与裸露的dsFASN相比，dsFASN-CS-FCN纳米颗粒显著增强了dsRNA在昆虫中肠液中的稳定性，从而使得dsFASN-CS-FCN纳米颗粒能够有效分布至中肠。重要的是，dsFASN-CS-FCN对豆象表现出较高的杀虫活性，处理后24小时的死亡率显著升高（58.00 ± 4.00%），产卵量减少（与对照组相比降低77.6%），基因沉默效率显著增强（FASN基因敲低75.8%），且三酰甘油（TAG）合成量减少（6.28 ± 0.28 ng/mg）。因此，FASN可作为害虫防治的一个潜在新靶标。dsFASN-CS-FCN纳米颗粒不仅表现出高稳定性和显著增强的杀虫效果，还提高了dsRNA的递送效率，从而确立了FASN作为害虫防治靶基因的可行性。这些结果为RNAi技术在该领域的应用提供了新的视角。

**引言**

目前害虫防控策略主要依赖于熏蒸剂和化学合成农药，这不仅会造成环境破坏，还导致昆虫对农药的抗性逐渐增强（Agour等人，2022）。RNA干扰（RNAi）是一种通过引入双链RNA（dsRNA）来诱导序列特异性内源基因沉默的方法（Jain等人，2020）。RNAi已成为昆虫学中最广泛使用的反向遗传学工具，并在害虫管理应用中展现出可观的潜力（Vogel等人，2019；Yan等人，2020）。RNAi作为生物农药的应用面临多重障碍，如dsRNA递送效率低、难以选择合适的靶基因以及核酸酶快速介导的降解等（Mehlhorn等人，2021）。因此，开发安全、稳定且高效的dsRNA递送载体材料对于害虫防治至关重要。

RNA干扰（RNAi）技术通过外源双链RNA（dsRNA）诱导靶基因沉默，为农业害虫的绿色防控提供了一种新方法。然而，研究发现这些作物的RNAi效率往往不足以用于实际田间应用（Parker等人，2019）。传统的dsRNA递送方法在田间应用中面临诸多瓶颈，而纳米颗粒介导的RNAi递送已被证明能够提高RNAi效率。因此，开发能够保护dsRNA并提高其递送效率的载体系统已成为该领域研究的优先方向（Yan等人，2021）。壳聚糖是一种安全、无毒且高度可再生的化合物，由于其具有较高的正电荷密度，能够通过静电作用与带负电的核酸形成多聚复合物纳米颗粒，因此被认为是理想的核酸递送材料（Dhandapani等人，2019；Liu等人，2024；Scarpin等人，2023；Zhou等人，2023）。

纳米颗粒已被证明具有广谱抗菌活性，除了其在核酸递送中的作用外（Ahmed等人，2025）。纳米颗粒的抗菌机制包括破坏膜完整性、产生活性氧物种（ROS）、抑制外排泵基因表达以及损害生物膜形成。例如，纳米颗粒处理已被证明可下调铜绿假单胞菌的mexY和大肠杆菌的rsbA等外排泵基因，从而减少生物膜形成和群集运动性（Mahdi等人，2024；Ahmed等人，2025b）。此外，金属氧化物纳米颗粒通过下调LuxS等群体感应相关基因，表现出显著的抗生物膜特性（Ahmed等人，2025b）。纳米颗粒制剂已应用于农业中的病害防控、农用化学品的靶向释放以及作物保护。由于其独特的理化性质，纳米颗粒在制药、化妆品、食品储存、水净化和农业等领域得到广泛应用（Salman等人，2025；Xia等人，2023）。与常规农药相比，纳米颗粒具有靶向精准、稳定性增强、生物利用度提高以及环境影响较小等优势。这些特性使纳米技术成为可持续农业实践的一种有前景的策略（Salman等人，2025）。

纳米材料在生物系统中的生物相互作用、生物分布、细胞摄取和命运，在很大程度上取决于其理化性质，如粒径、形状、粒径分布、化学成分、表面电荷、聚集状态、结晶度、孔隙率和涂层等（Bencsik和Lestaevel，2021）。纳米颗粒具有高比表面积。与体材料相比，纳米颗粒表现出增强的化学反应活性和生物活性。当纳米颗粒接触生物流体时，会迅速被生物分子冠层包覆，从而赋予其新的生物学身份，影响其表面电荷、分散性、转运、细胞结合和内化。表面电荷在纳米颗粒的清除和滞留时间中起着关键作用。因此，全面表征这些参数被认为是评估纳米载体系统性能和安全性的重要步骤（Abbasi等人，2023）。

壳聚糖纳米颗粒已成功应用于家蚕和棉铃虫等模式生物的有效递送中（Liu等人，2024；Kolge等人，2023；Ramesh Kumar等人，2016）。纳米颗粒可通过多种方法合成，包括化学还原法、利用植物提取物或微生物的绿色合成法，以及空化和声化学过程等物理方法。合成方法的选择对所得纳米颗粒的粒径、形貌和表面性质有重要影响，进而决定其生物活性和应用潜力（Xia等人，2023）。就合成方法而言，离子凝胶法和静电自组装法是制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒的常用策略。离子凝胶法因其反应条件温和、操作简单且无需使用有机溶剂而具有独特优势，通过优化壳聚糖与交联剂（如三聚磷酸钠）的质量比，可实现自发形成粒径可调（通常为100–200 nm）且表面正电荷（约+30 mV）的稳定纳米复合物。该方法已被广泛用于dsRNA的包封，包封效率超过80%。值得注意的是，岩藻多糖——一种阴离子硫酸化多糖——可通过静电作用引入该体系中，形成壳聚糖-岩藻多糖复合纳米颗粒，进一步增强载体的稳定性和生物相容性（Dhandapani等人，2019；Don等人，2026）。根据生物测定数据，饲喂壳聚糖/dsRNA纳米颗粒可实现60–80%的靶基因沉默效率，显著提高了包括蚊子、棉铃虫和蚜虫在内的害虫死亡率，并诱导了发育畸形和羽化失败等表型。此外，岩藻多糖是一种细胞壁多糖，通常由岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和硫酸基组成，与其他生物多糖相比，其生产成本较低。由于其硫酸基团的特殊结构和分布，岩藻多糖表现出显著的抗氧化和抗肿瘤活性，因此已被应用于药物递送系统中（Cabral等人，2021；Fitton等人，2019；Yuan和Macquarrie，2015）。此外，由于其阴离子特性，岩藻多糖可通过静电作用与带正电的壳聚糖形成纳米颗粒。岩藻多糖/壳聚糖纳米颗粒已在文献中多次报道，主要应用于药物递送和组织再生领域（Flórez-Fernández等人，2023）。

脂肪酸合酶（FASN）是从头脂质合成途径中的核心酶，催化饱和脂肪酸的合成。它参与多个关键过程，包括从头脂质生成（DNL）、三酰甘油合成与储存以及能量代谢。生物体中存在两种不同的FASN类型。I型FASN主要存在于动物和真菌中。在动物中，该类型以单一蛋白质形式表达并以同源二聚体组装（Lomakin等人，2007；Maier等人，2006）。II型FASN通常以独立的单结构域蛋白形式存在于细胞质中，在细菌和真核细胞器中尤为常见（Finzel等人，2015）。FASN单体包含七个不同的功能结构域：β-酮脂酰合酶（KS）、丙二酰-/乙酰转移酶（MAT）、β-羟脂酰脱水酶（DH）、烯酰还原酶（ER）、β-酮脂酰还原酶（KR）、酰基载体蛋白（ACP）和硫酯酶（TE）（Maier等人，2008）。

FASN在从头脂质生成（DNL）中发挥着核心作用（Heier和Kühnlein，2018；Toprak等人，2020；Toprak和Musselman，2021）。DNL是一种重要的代谢途径，将多余的碳水化合物转化为三酰甘油（TAG），从而作为主要的能量储存形式。从头脂质生成是一个复杂的代谢过程，以碳水化合物为原料，以二酰甘油为直接前体，随后酯化为TAG，构成储存脂质的绝大部分（>90%）。与糖原相比，TAG具有更高的热量密度，并能提供代谢水，是滞育、长距离飞行和胚胎发育的重要能量来源，可维持正常的生长和组织构建。然而，DNL的上调会导致TAG积累，DNL的异常上调是多种代谢疾病（包括非酒精性脂肪肝疾病和糖尿病）发病机制中脂肪质量增加的重要因素，也是肿瘤进展的关键因素（Arrese和Soulages，2010；Miao等人，2022）。

脂质代谢是一种基本的生物过程。在昆虫中，脂质作为膜的重要结构成分和必需的能量储备，支持发育、繁殖以及对饥饿的应答等关键生理功能。脂质储备的充足程度直接决定了昆虫的存活率和抗逆性；例如，脂质耗竭会显著降低昆虫对饥饿和氧化应激的耐受能力。此外，脂质储存对繁殖成功率影响深远，幼虫期积累的储备是成虫卵黄发生和产卵量的重要基础。研究表明，沉默FASN3会降低表皮脂肪酸和甲基支链烷烃的含量，从而破坏表皮的防水屏障，最终导致脱水死亡（Akhmetova等人，2021）。在甜菜夜蛾中，沉默SIFAS1显著抑制其脂质合成，导致幼虫存活率降低、羽化率减少等缺陷，从而阻碍正常发育和变态（Song等人，2022）。在埃及伊蚊中，沉默FASN会导致成蚊血餐消化延迟，并进一步降低脂质生物合成（Alabaster等人，2011）。

豆象（Callosobruchus maculatus，叶甲科豆象亚科）是热带地区仓储豆类的主要害虫，其对豆类种子的危害已在广泛的寄主上得到证实，包括豇豆、绿豆、红豆、兵豆、扁豆、普通菜豆、鹰嘴豆、小扁豆、花生和大豆等（Kalpna等人，2022；Sanon等人，2018；Tuda等人，2005）。豆象是导致豆类仓储损失10–20%的主要害虫。这是因为雌虫在种子表面产卵，孵化后的幼虫在种子内部发育，取食种子的胚乳和胚。随后幼虫化蛹并最终羽化为成虫，完成其生命周期。这一过程导致受侵染的种子逐渐中空，造成重量损失、穿孔和发芽能力下降。因此，豆象不仅对田间成熟豆荚和种子造成严重危害，而且在收获后储存期间也会造成损害。此外，由于其飞行行为，还可能造成跨区域危害。

本研究首先克隆了豆象FASN基因的全长序列并进行了功能表征，阐明了该基因在昆虫脂质代谢、存活和繁殖等关键生理过程中的具体作用。我们合成了dsFASN并评估了其作为害虫防治分子靶标的可行性。值得注意的是，本研究是壳聚糖-岩藻多糖纳米颗粒用于昆虫dsRNA递送的创新应用，并展示了口服dsRNA递送对仓储类豆象成虫的潜力。采用离子凝胶法以壳聚糖和岩藻多糖制备了dsFASN-CS-FCN纳米颗粒，旨在提高dsRNA在中肠环境中的稳定性。随后，采用动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和琼脂糖凝胶电泳等技术对dsFASN-CS-FCN进行了表征。此外，我们进一步研究了FCN-CS纳米颗粒介导的dsFASN递送系统对RNA干扰效率的影响，并系统评估了该载体介导的FASN基因沉默对害虫死亡率、脂质含量（TAG）和繁殖力的调控作用，建立了一种高效的害虫防治策略。

本研究旨在开发基于RNA干扰的绿色生物农药，解决传统RNA干扰技术常因双链RNA（dsRNA）在环境中不稳定及昆虫吸收效率低而受到限制的问题。本研究不仅在理论上阐明了关键代谢基因的功能，还在技术应用层面为绿色害虫防治提供了创新方案，为储藏物害虫的防治提供了新的思路，并为开发基于RNA干扰的新型生物农药提供了科学依据。这有助于减少化学农药的使用，符合可持续农业和绿色植保的发展需求。

章节片段

**昆虫饲养**

C. maculatus以绿豆（Vigna radiata (L.)）为饲料，每粒种子保持2至3头昆虫的密度，在28°C、相对湿度65%的环境控制箱中饲养。

**总RNA提取与RT-qPCR**

使用柱法总RNA提取试剂盒（Sangon，中国上海）从昆虫中提取总RNA。使用RNA试剂盒（GD3011，BioTek，中国北京）去除残余基因组DNA，并溶于无RNA酶水溶液中。使用Agilent 2100 Bioanalyzer系统配合RNA 6000 Nano试剂盒检测RNA完整性。

**CmFASN与同源蛋白具有高度序列相似性及结构域特征**

为探究dsRNA-CS-FCN在C. maculatus中的作用，利用RACE技术克隆了FASN基因的全长cDNA。CmFASN的全长cDNA（8283 bp）包含一个开放阅读框（ORF），编码2378个氨基酸（表S6）。其包含六个催化结构域：β-酮酰基合酶（KS）、丙二酰基/乙酰基转移酶（MAT）、脱氢酶（DH）、烯酰基还原酶（ER）、β-酮酰基还原酶（KR）和硫酯酶（TE），以及一个柔性连接的酰基载体蛋白（ACP）结构域。

**讨论**

害虫防治主要依赖于熏蒸法和化学农药。然而，环境污染和日益严重的农药抗性问题促使人们寻求更可持续的害虫防治方法。RNAi作为一种环保型害虫防治的前沿技术，代表了未来储粮害虫管理的一种新颖且前景广阔的策略（Joga等，2016年）。脂质作为不可或缺的能源底物，对昆虫的生长发育至关重要。这一过程关键地……

**作者贡献声明**

Xiao Li：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿件、可视化、验证、方法论、调查研究、形式化分析。Xuemei Sun：撰写——原始稿件、可视化、验证、方法论。Zhichao Wan：调查研究、形式化分析。Xiong Xiong：调查研究。Yujie Lu：指导监督。Sufen Cui：撰写——审阅与编辑、指导监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念设计。

**利益冲突声明**

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

**致谢**

本研究由国家自然科学基金资助（项目编号：32202294）。作者感谢江苏科技大学储藏物害虫防治实验室提供的技术支持。

**作者信息**

Xiao Li、Xuemei Sun、Zhichao Wan、Xiong Xiong、Yujie Lu、Sufen Cui

江苏科技大学粮食科学与技术学院，江苏镇江，212003，中国