《Nature Biotechnology》：Precise genomic integration of large DNA fragments by donor-directed annealing using prime editing
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在人类细胞中替换大片段仍然是一项重大挑战。本文提出一种可编程基因替换工具，命名为先导组装（prime assembly, PA），其利用先导编辑器在基因组和供体DNA上产生一对或两对3′端单链突出（3′-flap）。这些3′端突出能够像DNA寡核苷酸中的Gib
在人类细胞中替换大片段仍然是一项重大挑战。本文提出一种可编程基因替换工具，命名为先导组装（prime assembly, PA），其利用先导编辑器在基因组和供体DNA上产生一对或两对3′端单链突出（3′-flap）。这些3′端突出能够像DNA寡核苷酸中的Gibson组装一样精确地相互退火，从而可在目标基因处实现兆碱基级基因组切除和/或千碱基级供体插入。PA可接受DNA质粒和线性双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA）作为供体，片段大小为1.0–6.5 kb。研究人员在HEK293T细胞中证明，用2.9 kb供体DNA片段替换内源序列的效率最高可达57.8%，且整合的PA片段准确率>90%。此外，PA在原代人T细胞中可实现位点特异性嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）整合，效率最高达28.1%。通过水动力注射将含GFP供体的PA递送至小鼠后，在GFP阳性肝细胞中测得平均整合效率为4.3%。
研究背景与意义：遗传病由分布在大范围基因组区域中的多种致病突变引起。碱基编辑器（base editors, BEs）可纠正点突变，先导编辑（prime editing, PE）可修复几十个碱基对的插入缺失（indel），但人类细胞中大于千碱基（kb）的大片段DNA精确替换仍是难题。现有基于CRISPR核酸酶的方法如同源定向修复（homology-directed repair, HDR）、非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）、同源介导的末端连接（homology-mediated end joining, HMEJ）等依赖双链断裂（double-strand breaks, DSBs），会在靶位点产生非预期indel、大片段缺失、染色体畸变和细胞死亡。无DSB方法如PASSIGE等需要多步操作或效率较低，且没有系统能同时实现大规模删除与插入的精确基因替换。为此，研究人员开发了一种名为先导组装（prime assembly, PA）的可编程基因替换工具，实现了兆碱基级基因组切除和/或千碱基级供体插入，该研究发表于《Nature Biotechnology》。
主要关键方法：研究包括三种PA策略，即单flap PA（SF-PA）、带切口单flap PA（SFn-PA）和双flap PA（DF-PA）；利用PE7在基因组与供体DNA上产生互补3′-flap；用流式细胞术和数字PCR（digital PCR, dPCR）定量整合效率；用UMI标记的Oxford Nanopore长读段测序评估靶向整合精确性，
