宏基因组学揭示红海生命之网中的生物多样性

《Environmental Microbiology》：Metagenomic Insights Into Red Sea Biodiversity Across the Web of Life

　　

地球的生物多样性对生态系统健康与恢复力至关重要，提供着必要的功能与服务。红海是公认的海洋生物多样性热点区域，具有高度特有性和独特的环境条件，支撑着广泛但尚未充分解析的生物多样性。在此，研究人员对2022年红海十年考察（Red Sea Decade Expedition 2022）期间从沿海到深海环境采集的沉积物样本进行了宏基因组学（metagenomic）分析，以表征生命之网中的生物多样性。该策略通过每个样本的单次鸟枪法测序（shotgun assay），同时表征了沉积物微生物组（amplicon-based survey仅能通过并行的、靶向的测定获得），并将检测范围扩展至高等真核生物。利用高通量测序，研究人员生成了128亿条序列，揭示的类群覆盖了生命的所有域。尽管真核生物序列仅占分类注释数据集的0.7%，研究人员仍鉴定出679个真核生物科。原核生物多样性很高，这符合海盆尺度采样配合高测序深度的预期，其类群覆盖广泛的功能阵列。群落结构分析揭示了深海底栖微生物群落的深度驱动分层以及沿海底栖真核生物的纬度结构化。总体而言，该数据集提供了经验性的可靠性–覆盖度权衡，对针对保护优先类群的环境DNA（eDNA）监测项目设计具有直接影响，并为类群特异性参考数据库扩展提供了明确的优先方向。

宏基因组学揭示红海生命之网中的生物多样性：一项基于沉积物环境DNA的生态系统尺度评估

**研究背景与科学问题**

全球生物多样性正因气候变化和人类活动而加速丧失，这对生态系统功能与服务构成严重威胁。为应对这一危机，《昆明-蒙特利尔全球生物多样性框架》提出了“30×30”目标，即到2030年保护地球30%的陆地和海洋。然而，全球约有一万亿物种尚未被描述，尤其在高多样性且研究不足的生态系统中，这严重制约了基于信息的保护策略制定。过去二十年，扩增子测序（amplicon sequencing）虽极大推动了生物多样性研究，但存在引物偏好、分类覆盖不全和扩增效率差异等固有缺陷，且需通过16S、18S、ITS等多个平行测定才能分别表征原核生物、微生物真核生物和真菌。宏基因组学（metagenomics）通过对环境DNA进行随机鸟枪法测序，可绕过标记基因扩增，从单次测定中同时检测生命之网中的多样类群，并减少扩增子方法的偏差。然而，生态系统尺度上的宏基因组应用仍受限于复杂的生物信息学流程、数据管理负担和测序成本。红海作为一个全球独特的暖水海盆，具有高度特有性和独特的海洋水文特征，是研究生态响应的理想天然实验室。2022年启动的红海十年考察（Red Sea Decade Expedition, RSDE）旨在以前所未有的规模编目该生态系统的生物多样性。本研究利用RSDE采集的286份沿海至深海沉积物样本（沉积物天然富集环境DNA并减缓其降解），评估单次鸟枪法宏基因组测定在区域尺度上同时恢复生命之网各域生物多样性的能力、与独立基准的一致性及生态判别力。

**研究开展与主要结论**

研究人员对来自沙特阿拉伯专属经济区内的286份沉积物样本进行了深度鸟枪法宏基因组测序，共生成128亿条序列，覆盖细菌、古菌、真核生物和病毒等所有生命域。研究显示，单次测定能够同时恢复沉积物微生物组（原核生物、真菌、微生物真核生物）以及大型真核生物的检测信号，且其真核生物科的检出数量约为以往类似研究的2.5倍。然而，较低分类阶元（如物种水平）的注释可靠性受到参考数据库不完整的严重限制，尤其在脊索动物门中误注释较多。研究还揭示了开放大洋底栖微生物群落的深度驱动分层，以及沿海底栖真核生物群落的纬度和生境结构化。该数据集为设计针对保护优先类群的环境DNA监测项目提供了经验性的可靠性–覆盖度权衡依据，并明确了类群特异性参考数据库扩展的优先方向。论文发表在《Environmental Microbiology》。

**主要关键技术方法**

样本来源为2022年红海十年考察（RSDE），由两艘科考船在红海东部采集：R/V OceanXplorer号在开放大洋底栖带获取172份沉积物岩芯（深度42–2415 m），R/V Al Azizi号在沿海底栖生境（红树林、珊瑚礁、海草床）通过潜水获取114份沉积物样本（深度0.3–10 m）。方法包括：使用PureLink Microbiome Kit提取总DNA，采用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit构建文库，在Illumina NovaSeq6000平台以150 bp双端读取、每样本10 Gb深度测序；使用metaWRAP v1.3.2进行质控和组装，CD-HIT按95%相似性去冗余，prodigal预测编码序列（CDS），BBMap计算转录本每千碱基百万（TPM）归一化丰度；通过KAUST宏基因组分析平台（KMAP），用DIAMOND比对UniRef数据库（90%一致簇）并采用最近共同祖先（LCA）算法进行注释，过滤条件为覆盖度<80%、相似度<60%的比对结果；后续在R v4.3.2中用vegan、phyloseq等包进行中心对数比（clr）转换和主成分分析（PCA）。脊索动物注释需进一步按Global Biodiversity Information Facility（GBIF）红海记录和至少5条CDS阈值进行严格过滤。

**研究结果**

**3.1 分类注释总览**
通过对128亿条序列的分类注释，68.2%的序列成功分配至分类单元。细菌占注释序列的89.1%，古菌占10.0%，真核生物仅占0.7%，病毒占0.3%。其中真核生物序列的约23%（1300万条）属于Holozoa（动物及其最近单细胞亲缘）。

**3.2 真核生物多样性**
在真核生物域内，检测到已知65个海洋门中的44个，涵盖679个科，涉及11个主要真核超群中的9个。Holozoa覆盖最广（266科），Holomycota（真菌及其近缘）246科，Archaeplastida 103科。子囊菌门（Ascomycota）138科为最丰富的门。对脊索动物的细致检查发现，尽管存在非海洋物种的误注释（如蛙类、啮齿类、鲑形目），仍有16个脊索动物目依据GBIF记录确认为红海分布，包括29个物种；经严格过滤（至少5条CDS）后，物种数降至10个，分布于6个目。

**3.3 非真核生物多样性**
细菌方面鉴定出51门、122纲、268目，其中Pseudomonadota最为丰富（51个目），其次为Actinomycetota（40个目）和Cyanobacteriota（20个目）。古菌包括12门、22纲、38目，广古菌门（Euryarchaeota）多样性最高（15个目）。病毒检测到5门、8纲、19目，其中Preplasmiviricota最为普遍。

**3.4 海床深度和纬度对分类群落的影响**
对全部样本进行主成分分析（PCA）显示，开放大洋与沿海样本间存在强烈分离，可能与方法学和生态变量差异有关。开放大洋样本按深度类别清晰分开（浅底、中深底、深底），浅底样本与中深底和深底样本明显分离，其中真核生物门红藻门（Rhodophyta）和有孔虫门（Foraminifera）是区分浅底群落的贡献类群之一。沿海样本仅真核生物部分显示出按红海区域（纬度）和生境的分化：真核生物群落沿纬度形成北部、中部、南部三组，红树林与其他生境（珊瑚礁和海草床）显著不同；真菌门类对群落区分的贡献最大，Tardigrada与红树林样本强烈关联。

**讨论与结论**

**4.1 用宏基因组学评估红海生命之网的生物多样性**
原核生物占注释序列的99%以上，符合全球海洋沉积物趋势。真核生物仅占0.7%，但因其序列总量大，仍能实现广泛覆盖。约三分之一的序列无法注释，反映数据库参考序列的缺乏。病毒序列占比低并不代表实际丰度低，而是因病毒基因组小且DNA病毒参考不足。

**4.2 真核生物多样性**
检测到679个真核生物科，远超Stat et al. (2017)在类似研究中用扩增子测序获得的287个科。这表明在足够测序深度下，单次宏基因组测定可获得比多扩增子方法更广的高阶分类覆盖率。Holozoa在参考数据库中的过度代表性（占NCBIGenBank真核参考序列的67.2%）导致其检出偏向，而微生物真核生物参考不足。与红海后生动物条形码名录（Angulo-Preckler et al., 2024）相比，本研究检测到该名录未收录的轮虫动物门（Rotifera）和扁盘动物门（Placozoa），说明宏基因组能发现被低估或隐存的软体、小型类群。然而，CDS注释在低分类阶元误差较大，过滤后脊索动物多样性大幅下降，显示可靠性与覆盖度之间存在权衡，源于参考数据库不完整。

**4.3 非真核生物多样性**
单次鸟枪法同时获得了16S等价的原核生物、ITS等价的真菌、COI等价的后生动物和18S等价的微生物真核生物信息，避免了多扩增子的引物偏差和独立数据库需求。非真核生物中，细菌主导丰度和多样性，Pseudomonadota、Actinomycetota等门类参与有机物降解和生物地球化学循环；古菌中的广古菌门在甲烷产生中发挥关键作用；病毒通过病毒分流和转导影响微生物群落动态与基因交换。

**4.4 生态梯度判别**
开放大洋样本的深度分层与RSDE扩增子研究及经典动物学调查一致，表明深度相关环境梯度（光照、有机质输入、氧化还原条件）控制底栖群落组成。沿海样本的真核生物部分呈现纬度和生境分化，但非真核部分未显示生境分层，且开放大洋样本未重现纬度梯度，与扩增子研究结果不一致。这主要归因于宏基因组注释分辨率不足和误注释率高，参考数据库的不完整限制了当前宏基因组在红海中解析环境–群落关系的能力。

**结论**
本研究以生态系统尺度评估了宏基因组学在生物多样性调查中的效能。通过每样本单次鸟枪法测定，该调查恢复了扩增子表征至少需要三个平行测定才能获得的完整底栖微生物组，并将检测扩展至真核生命之网中的高等真核生物。这是迄今首次在海盆尺度证明单次测定优势可用于如此规模的环境DNA调查。然而，当前方法存在明显局限：高等真核生物在科级以下的分类分辨率不可靠，保守的编码序列过滤使脊索动物物种数从29降至10个，并移除保护优先物种。这些局限反映世界大部分地区参考数据库的不完整性，必须在实现可靠低阶元鉴定前加以解决。尽管本研究仅基于分类学，该数据集是可重复使用、多组学就绪的资源：286个宏基因组可无需重新测序而用于基因组组装、功能和抗生素抗性基因分析、病毒和移动元件多样性研究，并支持未来的宏转录组和宏蛋白质组工作。这与扩增子固定数据集形成鲜明对比，也解释了选择海盆尺度鸟枪法设计的原因：相关比较不是鸟枪法对单一扩增子，而是鸟枪法对至少三个（16S、18S、ITS、加病毒）平行测定，且鸟枪法数据可重分析和向前兼容。研究人员将该数据集及其基于标准的评估作为设计未来生态系统尺度生物多样性评估的基础，指出了单次测定宏基因组目前足以独立应用的分类阶元和领域、仍需与扩增子互补的方面，以及需通过提升参考数据库完整性、每样本测序深度和过滤标准来解决的关键瓶颈。