用于反相液相色谱-荧光检测快速基线分离八种生育色烷的单分散全多孔五氟苯基固定相：与表面多孔及常规全多孔颗粒技术的性能比较

《Microchemical Journal》：Monodisperse fully porous pentafluorophenyl stationary phase for rapid baseline separation of eight tocochromanols by RPLC-FLD: performance comparison with superficially and conventional fully porous particle technologies

　　摘要- RPLC色谱柱比较：浅表型（SPP）、单分散型（MFPP）和常规型（CFPP）。- 与SPP和CFPP相比，MFPP色谱柱实现了更优的生育酚和生育三烯酚分离。- MFPP PFP色谱柱可在13分钟内实现8种生育酚的基线分离。- 使用MFPP PFP实现了α-生育烯醇这一第九种生育酚的分离。- 该方法已针对24种植物样本进行了验证，这些样本的生育酚谱高度多样。引言生育酚是一类结构相关的亲脂性植物代谢物，包括四种生育酚（α-、β-、γ-和δ-）、四种生育三烯酚（α-、β-、γ-和δ-），以及一系列含量较少的同类物，包括生育烯醇和叶绿体醇-8。主要生育酚和生育三烯酚同系物共享一个色满醇头基，但甲基取代基的数量和位置不同；生育三烯酚在植醇衍生的侧链上还额外具有三个双键。在植物中，这些化合物是光合膜的重要组分，有助于保护脂质免受氧化应激，并参与超越抗氧化的功能。在食品体系中，它们的存在，尤其是在叶片、种子、谷物、坚果、豆类和植物油中，既影响营养价值，也影响氧化稳定性。生育酚、生育三烯酚和其他生育酚统称为维生素E。然而，严格意义上的营养学维生素活性专属于α-生育酚，这源于其被人体α-生育酚转运蛋白优先识别和保留。因此，尽管其他生育酚结构相似且具有报道的生物活性，仍不应将其视为与α-生育酚在营养上等同。生育三烯酚、生育烯醇及其他微量生育酚因其发生模式、理化性质和生物学效应可能与α-生育酚存在显著差异而备受关注。因此，全面测定完整的生育酚谱对食品与药品质量评估、营养表征、化学分类学研究、植物来源材料的鉴定以及植物脂质代谢研究均具有重要意义。生育酚的分析谱测定，尤其是微量组分，仍然具有挑战性。在许多食品基质中，α-和γ-生育酚占主导，而β-和δ-同系物、生育三烯酚及微量化合物的浓度明显较低（个别例外除外）。这种组成失衡可能导致在不充分分辨邻近洗脱化合物的色谱方法中，出现不完整鉴定或定量不准确的情况。特别是，β/γ-生育酚和β/γ-生育三烯酚位置异构体对是关键的测定对象。这些分析物具有相同的分子质量，且理化性质和光谱性质高度相似；因此，在需要明确归属时，质谱检测无法替代色谱分辨率。结合荧光检测的RP-HPLC仍然是天然生育酚常规测定的高度合适方法，因为色满醇部分具有内在荧光、灵敏度高且仪器普遍可得。然而，常规辛基硅烷（C18）相通常无法提供足够的选择性来分离β/γ异构体对。这一局限性促使人们评估替代的RPLC固定相，包括三烷氧基硅烷（C30）、五氟苯基（PFP）、萘乙基（πNAP）、2-(1-芘基)乙基（5PYE）以及嵌入C18链的酰胺基（RP-amide）相。在这些材料中，PFP相被认为对生育酚分析特别有用。其保留行为不仅反映疏水相互作用，还涉及偶极、π–π、空间位阻及与氟相关的选择性机制，从而可改善结构相似芳香分析物的鉴别。然而，仅选择性并不能决定RPLC色谱柱的实用性。因此，近期色谱颗粒工程的发展聚焦于在保持与传统HPLC系统兼容的同时提升柱效。浅表型多孔颗粒（SPPs，也称核壳颗粒）包含一个无核外多孔壳层。其缩短的扩散路径可在中等背压下实现快速传质和高柱效，使SPP色谱柱对高通量分离颇具吸引力。相反，常规全多孔颗粒（CFPPs）因其稳健性能、广泛可得性和在众多RPLC方法中的成熟适用性而仍被广泛使用。而单分散全多孔颗粒（MFPPs）则是固定相技术更近期的发展。这些材料保留了全多孔硅胶特征性的高比表面积和负载能力，同时旨在实现比常规全多孔填料更窄的粒径分布。此类设计可能影响填料床的同质性、渗透性以及柱效与压力之间的平衡；然而，粒径分布与实际柱效之间的关系复杂，无法仅从颗粒形态推断。事实上，关于填料床结构与粒径分布的研究表明，柱制备、颗粒性质和径向床层非均质性可能与粒径均匀性本身同样重要。因此，需在实际相关条件下进行直接比较，以确定某种颗粒技术的理论优势是否能在化学上具挑战性的分析物分离中体现为实际改善。此外，这些颗粒技术在分辨微量生育酚（如α-生育烯醇）方面的适用性仍需进一步评估。尽管PFP固定相在生育酚分析中的潜力已被证实，但关于颗粒与填料床技术对这类固定相实际分离性能影响的重要知识空白仍然存在。既往研究主要聚焦于单个PFP色谱柱的色谱选择性，而对MFPP、SPP和CFPP基PFP色谱柱在可比较的RPLC-FLD条件下进行系统比较尚未充分建立。因此，MFPP更窄的粒径分布及可能改善的填料同质性，是否能在关键β/γ-生育酚和β/γ-生育三烯酚异构体对的分离中带来可测量的优势仍不清楚，尤其是当分辨率与分析时间和操作压力共同考虑时。此外，MFPP基PFP相对微量生育酚（如α-生育烯醇）分离的适用性仍未见文献记载。因此，本研究比较了三种PFP RPLC色谱柱技术——MFPP、SPP和CFPP——用于基于荧光检测的生育酚测定。研究了流动相含水量和柱温对关键异构体对分离的影响，并将优化条件应用于一系列多样的植物来源基质。特别关注了α-生育烯醇的色谱行为，以及分辨率、分析时间和操作压力之间的实际关系。位置异构体和微量同系物分辨率的提升直接增强了对化合物鉴定、定量以及食品和植物代谢物数据解释的信心。片段试剂高效液相色谱（HPLC）级乙醇（≥ 99.8%）、乙酸乙酯、甲醇和正己烷，以及分析级没食子酚、氢氧化钾和氯化钠，均由Sigma-Aldrich（德国施泰因海姆）提供。工业级乙醇（96.2% v/v）购自Kalsnavas Elevators（拉脱维亚Janikalsnava）。四种生育酚类似物（α-、β-、γ-和δ-）的参考标准品（≥ 98%，HPLC级）购自Extrasynthese（法国Genay），而……MFPP与CFPP和SPP色谱柱的比较在优化的第一阶段，评估了甲醇基流动相中水含量对关键β/γ-生育酚异构体对分离的影响。实验使用MFPP Evosphere PFP色谱柱进行，水含量分别为5、7、9和11%（v/v），同时保持柱箱温度为30 °C。此阶段的目标是实现两个关键异构体对β/γ（图1）的基线分离，定义为Rs ≥ 1.5。在水含量……结论总之，结果表明在所考察的色谱条件下，MFPP Evosphere PFP色谱柱在三种测试颗粒技术中提供了色谱选择性、分析时间和操作压力之间最有利平衡。使用MFPP Evosphere PFP色谱柱，配合含9%（v/v）水的甲醇基流动相及30 °C的柱温，可在13分钟内以……实现所有八种主要生育酚的基线分离。作者贡献声明Pawe? Górna?：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式分析、数据整理、构思。基金本研究由拉脱维亚科学委员会资助，项目为“生育三烯酚与叶绿体醇：其发生、测定、分离与应用的新方面（TOCO-SOURCE-SOLUTIONS）”，编号lzp-2024/1-0600。利益冲突声明作者声明不存在已知的、可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。致谢我谨感谢Ingus Pērkons博士，他为α-生育烯醇的LC-HRMS鉴定做出了贡献。Pawe? Górna?