热提取普雷克塞果（Tetrapleura tetraptera）的风味演变特征分析：整合感官分析、电子鼻、色谱分析、化学计量学与分子对接技术

《Microchemical Journal》：Characterizing flavor evolution in heat-extracted Prekese fruits ( Tetrapleura tetraptera): Integrating sensory analysis, E-nose, chromatography, chemometrics, and molecular docking

　　

•采用化学计量学方法对不同萃取时长的Prekese果实提取物进行判别分析。
•在四个萃取时长下识别出Prekese中35种差异性挥发性化合物。
•利用UHPLC-MS/MS筛选出与Prekese果实风味相关的23种化合物。
•OR5M3和OR2W1与Prekese果实中的主要酯类表现出最强的结合能。
•乙酰戊烯酸乙酯和丁烯酸正丁酯是Prekese果实香气的关键化合物。

**引言**

Aidan果实（*Tetrapleura tetraptera*），在加纳阿散蒂人中被称为"Prekese"，是一种传统的西非水果，因其独特的香气、风味和潜在的健康益处而被广泛用于功能性饮料和草本制剂中[1]、[2]。该植物分布于加纳、尼日利亚、冈比亚、贝宁、乌干达、布基纳法索、坦桑尼亚、喀麦隆、毛里塔尼亚、尼日尔以及其他亚洲国家。成熟的干燥果实被广泛用作香料、酒精及非酒精饮料以及传统药物[2]。众多研究者揭示，Prekese果实提取物具有抗菌、抗真菌、杀裂殖体、杀疟原虫、杀软体动物、杀蠕虫等多种生物活性[3]、[4]、[5]。Prekese果实的浸泡液在当地也被用作药物，作为补品和兴奋剂，用于治疗咳嗽、哮喘和消化系统疾病[6]。

研究者已鉴定出该果实含有挥发性化合物和植物化学物质，如单宁、生物碱、多酚、黄酮类、甾体、皂苷、蒽醌、腐殖酸类、糖苷和蒽醌等[1]、[4]、[6]、[7]。这些生物活性成分对人体健康具有积极影响[5]。多种生物活性物质的存在彰显了Prekese果实用于功能性食品和药用制剂的潜力[6]。

Prekese饮料的风味是一项关键的质量特征，显著影响消费者接受度，且对加工条件，尤其是热水萃取，尤为敏感。热处理可显著影响挥发性成分谱、风味相关化合物和理化品质，从而影响总风味的释放。据我们所知，仅有少数研究报道了Prekese果实的挥发性成分[1]、[8]。此外，尽管此前已报道过Prekese饮料中出现的苦涩回味[9]，但导致该风味的化合物尚未被探讨。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已被用于水果代谢物图谱分析[10]。气相色谱（GC），通常与质谱和感官相关方法结合使用，已被用于鉴定挥发性标志物和有助于食物风味的关键香气活性化合物。香气显著性通常使用嗅阈活性值（OAV）、嗅贡献（OC）和风味稀释（FD）等指数进行评估，而多变量统计分析，包括正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），已被应用于样品判别和特征挥发性化合物的鉴定[10]、[11]、[12]、[13]。尽管感官分析和仪器方法已被用于测定Prekese浸泡液的香气，但它们对特征香气的形成机理提供的信息有限，因为特定香气化合物与嗅觉受体（ORs）之间的相互作用鲜有被探索。

因此，分子对接有助于全面理解香气化合物与人体嗅觉受体之间的相互作用机理，从而能够在受体水平上阐释风味感知[13]。然而，这些整合方法尚未被应用于Prekese果实饮料，迄今为止，尚无系统研究结合感官、仪器和分子分析来考察热水萃取Prekese饮料中风味的释放机理。

本研究的目标为：(1) 探索Prekese果实在不同热水萃取时长（0、15、30和45 min）过程中挥发性化合物的动态变化；(2) 通过OAV和嗅OC鉴定关键香气化合物；(3) 评估加热对感官属性、电子鼻响应、色泽特性和可溶性固形物的影响；(4) 探索Prekese饮料特征香气的分子识别机理。此外，采用超高效液相色谱-Orbitrap质谱（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS/MS）筛选影响Prekese果实饮料风味的潜在化合物。本研究为Prekese果实饮料中风味释放机理提供了新的见解，为优化品质和开发功能性饮料提供了科学依据。

**材料与方法**

盐酸购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。甲醇和乙腈（HPLC级）购自旭兴高纯溶剂有限公司（中国）。内标薄荷醇购自赛默飞世尔科技公司（中国上海）。C7至C40的饱和烷烃由Sigma-Aldrich公司（美国怀俄明州拉腊米）提供。Prekese果实（*Tetrapleura tetraptera* L.）采集自加纳北部地区塔马利当地市场。样品经加纳塔马利发展研究大学农业、食品与消费者科学学院食品科学与技术系Gustav Komla Mahunu教授鉴定确认。样品在60°C烘箱中干燥2小时，使用电动研磨机研磨，并通过500 μm筛网获得Prekese果粉。筛分后的粉末储存于密封棕色塑料瓶中，室温保存至进一步分析。

**2.1 Prekese饮料的制备**

取3.51 g Prekese粉末，在130 mL水中煮沸至100°C，随后降温至75±5°C，并在不同萃取时长（0、15、30和45 min）下保温，制备Prekese饮料以供感官评价。"0 min萃取物"样品指在沸水（100°C）中混合后立即获得的萃取物。萃取后，Prekese饮料通过Whatman No. 1滤纸过滤去除不溶颗粒，滤液用于可溶性固形物测定和感官评价。感官评价小组由江苏大学食品科学与工程学院的8名经培训的评估员（4名女性和4名男性）组成。尽管该小组规模在经培训描述性感官研究中常用的范围内，但评估员数量相对较少可能会限制感官结果的统计效力和泛化性。

感官分析采用此前报道的方法[14]。具体而言，取15 mL各过滤后的Prekese饮料样品倒入品鉴杯中，并使用随机三位数编号。六种香气属性，包括果香、焦糖香、花香、甜味、酸味和苦涩回味，被用作评价参数。感官评估在室温（25°C）下进行，每种属性的强度按0-8分制评分。计算不同加工时长下各属性的平均得分，绘制香气描述的雷达图。

**2.3 总可溶性固形物的测定**

使用烘干法测定过滤液萃取物的总可溶性固形物（TSS）。取10 mL萃取物（9.41±0.15 g），在105°C下干燥2小时，TSS以g/100g粉末表示：

$$TSS = \frac{W_2 - W_0}{m} \times 100$$

其中，$W_2 - W_0$ 为干燥可溶性固形物的质量（g），$m$ 为用于萃取的粉末质量（g）。

**2.4 色泽参数的测定**

使用便携式色度计（EVERFINE，PSC-30；中国）评估液态Prekese样品的色泽参数（L、a和b*）。样品经充分混匀后置于光程长度为10 mm的透明玻璃比色皿中。对每个样品在三个不同位置进行色泽测量，并记录平均值。

**2.5 挥发性化合物的提取与分析**

取2 g Prekese粉末（置于样品瓶中），在12 mL水中煮沸至100°C，随后降温至75±5°C，在不同萃取时长（0、15、30和45 min）下保温，制备Prekese饮料以供感官评价。挥发性化合物采用顶空固相微萃取（SPME）技术提取，使用50/30 μm 二乙烯基苯（DVB）/Carboxen（CAR）/聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取头（10 mm，Supelco，美国PA），参照文献方法[11]。使用配备Rtx-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；Shimadzu，美国）的气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）GCMS-TQ8040（Shimadzu，日本京都）。由于并非所有鉴定化合物均有真实标准品可用，因此采用半定量内标法估算VOCs的浓度。具体而言，取20 μL薄荷醇（100 μg/μL）作为内标，根据各化合物峰面积与薄荷醇峰面积的比值计算VOCs的相对浓度[10]。所得数值用于样品间VOCs图谱的比较分析。

挥发性化合物的鉴定通过搜索国家标准与技术研究所（NIST）MS光谱数据库（美国华盛顿特区）并比较使用C7至C40烷烃计算的Kovats保留指数（RI）予以确认。所鉴定化合物的浓度以薄荷醇（内标）等效量表示。

**2.6 电子鼻分析**

Prekese果实的电子鼻分析参照文献[15]进行，并作少量修改。2.2节中的萃取物用于电子鼻分析。电子鼻（PEN3，Airsense Analytics GmbH，德国施韦林）配备10个金属氧化物传感器，包括W1C（芳香族）、W5S（广谱）、W3C（芳香族）、W6S（氢气）、W5C（芳香-脂肪族）、W1S（广谱-甲烷）、W1W（硫化物-有机物）、W2S（广谱-醇类）、W2W（硫化物-氯化物）和W3S（甲烷-脂肪族）。具体而言，在10 mL顶空样品瓶中加入5 mL Prekese饮料并密封。为使顶空挥发性化合物产生，样品瓶在45°C恒温水浴中平衡15 min。然后依次将样品导入系统。测量150秒后，进行120秒冲洗以恢复至基线条件。为进一步数据分析，采用100秒内从10个传感器收集的可靠响应信号。每个样品进行三次平行测量。

**2.7 香气贡献的计算**

为评估每个萃取时长下Prekese果实饮料中各VOC对风味图谱的贡献，按各挥发性化合物浓度与其在水中嗅阈值的比值计算差异性化合物的OAV[10]。阈值数据来自在线数据库（https://www.vcf-online.nl/）和已发表文献[16]、[17]、[18]、[19]。由于VOC浓度采用内标法估算，因此使用文献报道的嗅阈值数据进行OAV计算。各挥发性化合物的贡献通过OAV和嗅阈活性值总和（SOAV）计算：

$$OC = \frac{OAV}{SOAV} \times 100$$

在本研究中，选择VIP≥1且嗅贡献最高的差异性挥发性化合物作为配体。六个研究充分的嗅觉受体（即OR1A1、OR1G1-1G1、OR2W1、OR5M3、OR7D4和OR8D1）已被用于分子对接以研究其潜在相互作用机理[10]、[12]。

**2.8 分子对接**

分子对接使用分子操作环境软件（Chemical Computing Group Inc.，MOE 2024）进行。挥发性与非挥发性化合物的三维结构表示从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取。嗅觉受体从蛋白质数据银行（https://www.rcsb.org/pages/about-us/index）获取。加载受体后，移除水分子以及与小配体相关的无关异配体或离子。随后，将受体纳入"Surface菜单"，调整其透明度，进行能量最小化，识别结合位点，并使用对接功能推导对接结果。

**2.9 味觉相关化合物的提取与分析**

萃取按我们建立的方法[20]进行，并作少量修改。具体而言，取1.0 g Prekese果粉，在30 mL 80%乙醇和30 mL纯化酸化水（0.1% HCl）中于40°C下磁力搅拌20 min。此萃取步骤用另外30 mL各溶剂重复一次，所得滤液通过Whatman No. 4滤纸去除固体颗粒。随后在60°C下使用旋转蒸发仪蒸发萃取物。干燥后的物质溶于30 mL酸化水（0.1% HCl）中，在5000×g条件下离心10 min。样品纯化使用预处理好的Water Sep-Pak C18柱（Applied Separations Inc.，美国宾夕法尼亚州阿伦顿）。用2 mL甲醇从C18柱中洗脱代谢物，通过0.22 μm膜滤器过滤，储存于7°C棕色样品管中。

代谢物使用超高压液相色谱仪（UHPLC，Dionex UltiMate 3000，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）分析，该系统配备脱气装置、工作压力为1250 bar的四元UHPLC泵和自动进样器。色谱分离使用Thermo Fisher Scientific Hypersil GOLD VANQUISH C18柱（1.9 μm，aQ 100×2.1 mm）。UHPLC-Q-Orbitrap-MS2的具体操作参数与我们先前工作中使用的参数相同[10]。

**2.10 代谢组学数据处理与化合物鉴定**

为进行代谢组学解析，将UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS2代谢组学分析获得的总离子流图（TIC）的未经处理的质谱数据传输至Compound Discoverer 3.1（Thermo Fisher Scientific，美国）进行光谱处理，主要包括峰提取、保留时间校正、加性离子池化、缺失数据填充以及代谢物鉴定。此外，代谢物鉴定结果系统地查询了多个数据库，包括ChemSpider、Metabolika Pathways、mzCloud和mzVault。

峰选择过程采用强度容差为30%、强度阈值为0.1%、信噪比（S/N）阈值为3、最小谱图拟合要求为30%、最小模式覆盖标准为80%的条件进行执行。碎片匹配采用质量容差为5 ppm、信噪比（S/N）为3的条件进行 [10]。代谢物鉴定置信等级按照代谢组学标准倡议（MSI）进行分配，通过准确质量和MS/MS碎片匹配数据库鉴定但无真实标准的化合物被归类为推定注释化合物（2级）。在进行化学计量分析之前，采用单位方差（UV）标度法通过标准差标准化所有变量，确保等权重。随后采用正交投影到潜变量判别分析（OPLS-DA）来识别对组间区分负责的关键电子鼻传感器和差异挥发性化合物。在OPLS-DA模型中，GC-MS和电子鼻数据作为自变量（X），预克塞果实提取时间作为因变量（Y）。模型在SIMCA 14.1（Umetrics，美国新泽西州金内尔）中开发，使用7折交叉验证和95%置信水平确定模型复杂度。模型稳健性和过拟合通过基于R2Y和Q2Y值的200次置换检验进行评估。VIP评分大于1.0的变量被视为对组间区分的显著贡献者。使用Heml 1.0（热图插图工具）生成聚类热图 [21]。图表和图形使用OriginPro 2024（OriginLab Corp.，美国马萨诸塞州诺斯安普顿）生成。所有实验均重复三次。使用Minitab软件（Minitab，美国宾夕法尼亚州州学院）进行单因素方差分析及Tukey事后检验，以评估显著差异（α = 0.05）。

Prekese提取物的总可溶性固形物及颜色特征研究结果表明，延长提取时间会显著影响Prekese提取物的颜色特征和总可溶性固形物（TSS）（表1S）。TSS在0至45分钟内随时间增加，表明延长加热改善了糖和其他可溶性成分的溶解。颜色测量呈现出动态趋势：亮度（L*）在15分钟时增加，表明色素提取得到增强，但在后续时间逐渐下降。

本研究有效整合了化学分析、感官分析、化学计量学和分子对接，阐明了Prekese饮料的风味和品质特征。基于香气活性值（OAV）、气味贡献和VIP分析，识别出挥发性成分的差异，确认了其在定义特征香气谱系中的核心作用。电子鼻数据和感官评价与实验结果表现出显著一致性，确认了所观察到的香气特征。

作者贡献声明：Haroon Elrasheid Tahir：初稿撰写，资金获取。Sulafa B.H. Hashim：调查，资金获取。Muhammad Arslan：数据整理。Gustav Komla Mahunu：审校和编辑。Hamza A.M. Abaker：调查。Alaa K.M. Khogly：正式分析。Mohammad Rezaul Islam Shishir：方法学。Naymul Karim：可视化。Li Zhihua：软件。Chenguang Zhou：可视化。Abdalbasit Adam Mariod：项目管理。Xiaongdong Zhai：验证。Zou Xiaobo：

利益冲突声明：作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢：本研究得到中国国家自然科学基金 [基金编号：3175011045；32350410402] 和国家重点研发计划项目 [2024YFE0117000] 的支持。我们感谢Gifty Selorm Bansah（加纳塔马勒发展大学农业学院家庭与消费者科学系讲师）支持Prekese果实样本的采集。

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