《Microchemical Journal》：AChE-activatable turn-on fluorescent probes for real-time monitoring of drug release in Parkinson's disease models
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开发了三种由乙酰胆碱酯酶（AChE）激活的荧光探针（ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3）。
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开发了三种由乙酰胆碱酯酶（AChE）激活的荧光探针（ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3）。
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ZGT-3 显示出依赖AChE的荧光激活和双硫仑释放。
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ZGT-3 在帕金森病（PD）细胞模型中表现出强烈的神经保护作用。
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ZGT-3 在斑马鱼模型中成功用于抑制活性氧（ROS）的生成。
引言
帕金森病（PD）是全球第二常见的神经退行性疾病，其特征是多巴胺能神经元的进行性丢失和慢性神经炎症[1]、[2]。实时监测药物释放并同时调节与疾病相关的酶生化标志物是开发PD靶向治疗策略的关键挑战之一[3]。在涉及PD的各种炎症途径中，含有 maj? domain 3（NLRP3）的NOD样受体家族炎性小体最近受到了广泛关注[4]、[5]、[6]、[7]。NLRP3的激活会触发依赖caspase-1的IL-1β成熟，并导致由gasdermin D（GSDMD）执行的焦亡性细胞死亡[8]。然而，目前能够同时实时监测NLRP3相关炎症状态并进行治疗干预的方法仍然有限。大多数现有的荧光探针仅用于成像，缺乏治疗功能，而传统的前药策略无法提供关于药物释放的实时反馈[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。将选择性传感与靶向递送整合到一个平台上，可能会为克服这一瓶颈并提供综合诊疗方法提供一条可行途径。
双硫仑（DSF）是一种获得FDA批准用于酒精厌恶疗法的药物，最近有研究表明它可以通过调节NLRP3的棕榈酰化来抑制NLRP3炎性小体[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。这一作用可以抑制焦亡性细胞死亡和IL-1β的释放[20]。在PD的背景下，双硫仑已被证明可以减轻小胶质细胞的激活，减少多巴胺能神经元的丢失，并改善动物模型的运动功能[21]、[22]。然而，由于双硫仑的非选择性生物分布，其在PD治疗中的临床应用受到限制，这会导致脱靶效应和潜在的全身毒性[23]。因此，需要一种能够将双硫仑精确递送到发炎脑区同时最小化全身暴露的靶向递送策略。提高双硫仑生物利用度的一个有前景的方法是前药策略。例如，He等人设计了一种基于双硫仑的前药DQ，它可以在细胞中对过氧化氢作出反应（图1A）[24]。受到这种前药设计的启发，我们试图利用发炎脑区中的疾病相关信号来触发双硫仑的靶向递送。
乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种在周围神经系统中水解乙酰胆碱（ACh）的关键酶，从而维持ACh的稳态并促进正常的神经信号传递[25]。虽然传统上认为AChE主要位于胆碱能突触处，但最新研究发现，在多种神经系统疾病中，AChE在病理病变周围的区域显著上调[26]、[27]、[28]。例如，在癫痫持续状态的大鼠颞叶结构中，AChE上调[29]。同样，在PD等神经退行性疾病中，AChE在病理病变附近的区域表达增加，包括活化的微胶质细胞、反应性星形胶质细胞和神经炎性斑块[30]、[31]、[32]。Tang的团队开发了一种荧光探针（MCYN），用于实时可视化应激诱导抑郁表型中的AChE，证明了使用AChE作为疾病状态生物标志物的可行性（图1A）[33]。这种AChE的病理性积累为靶向药物递送提供了一个明确的“病理地址”。
在本文中，我们设计并合成了一系列由AChE激活的荧光探针，分别命名为ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3。这些探针通过将双硫仑衍生物与自氧化荧光团通过AChE可切割的连接剂连接起来构建[33]、[34]、[35]。荧光团来源于V. Venkatesh及其同事之前报道的荧光前药5-FUPD（图1A）[36]。在没有AChE的情况下，前药保持无活性且不发光。当这些探针进入发炎区域并与富含AChE的环境接触时，连接剂被切割，释放出双硫仑并激活荧光，从而实现药物释放的实时可视化（图1B）。在所测试的探针中，ZGT-3在PD细胞模型中表现出神经保护作用，包括提高神经元存活率、降低ROS水平、减轻线粒体膜电位下降以及下调与NLRP3炎性小体相关的蛋白质。与现有的对H2O2反应的双硫仑前药相比，我们的AChE响应设计通过利用发炎区域AChE的病理性上调提高了选择性。荧光激活机制不仅能够灵敏地检测酶活性，还能提供关于药物释放的实时反馈，解决了传统疗法中缺乏时空控制的问题。
章节片段
通用信息
有关GTBr-1、GTBr-2 和 GTBr-3的制备所用材料、仪器和程序的详细信息，以及它们的完整光谱特性，见支持信息（图S1）。使用了单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验来进行组间差异分析。
ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3 的通用制备方法
GTBr-1、GTBr-2 和 GTBr-3 分别通过类似的程序转化为ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3。典型的实验包括溶解
探针在PD细胞模型中的细胞毒性
在成功合成三种AChE响应探针（图1A）后，我们接下来在PD的细胞模型中评估了它们的生物活性。在评估合成探针的神经保护作用之前，首先使用MTT试验评估了它们的内在细胞毒性。如图1B所示，SH-SY5Y细胞与不同浓度的ZGT-1、ZGT-2 和 ZGT-3共培养24小时。这三种探针均未表现出显著的细胞毒性。
结论
总之，我们成功设计并合成了三种AChE激活的荧光探针（ZGT-1、ZGT-2、ZGT-3），这些探针结合了实时药物释放监测和靶向的双硫仑递送功能。系统评估表明ZGT-3是最佳候选者，它具有高AChE选择性、强烈的荧光激活效果和强大的神经保护作用。新斯的明抑制实验证实了ZGT-3在活的SH-SY5Y细胞中依赖于AChE的激活。从机制上讲，ZGT-3减轻了
本手稿的最终版本已经得到了所有作者的批准。最初的想法和研究设计由X.J.L.提出。数据分析、图表制作和初稿由J.W.和X.J.L.完成。探针的合成由J.W.和Y.Z.负责，而理论计算由R.J.完成。荧光成像由R.J.、Z.G.S.和L.L.共同完成。手稿由Y.Q.、Tony D. James和X.J.L.审阅和修改，他们还提供了
CRediT作者贡献声明
Jing Wang：撰写——初稿，数据整理。 Yu Zeng：撰写——初稿，数据整理。 Ran Ji：验证，数据整理。 Ling Li：数据整理。 Zhigang Sun：资源提供。 Tony D. James：撰写——审阅与编辑，资金获取。 Xiangjie Luo：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，资金获取，概念化。 Yong Qian：撰写——审阅与编辑，资金获取，概念化。
资金来源
作者感谢国家自然科学基金（编号22477061、22507057）和江苏省自然科学基金（编号BK20240580）的支持。T. D. J. 还感谢巴斯大学和河南师范大学化学与化工学院的开放研究基金（编号2020ZD01）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。
Jing Wang|Yu Zeng|Ran Ji|Ling Li|Zhigang Sun|Tony D. James|Xiangjie Luo|Yong Qian
