PMS2 基因敲除诱导一种以 6-TG t... 为特征的错配修复缺陷表型

《Cancer Discovery》：PMS2 KO induces an MMR-d phenotype characterized by 6-TG t...

　　

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摘要

DNA错配修复（MMR）可检测并纠正复制后发生的DNA改变；在高达20%的人类癌症中该功能失调。MMR缺陷型（MMR-d）癌症表现出升高的肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI），并符合检查点抑制剂（CPI）免疫疗法的适应证，通常能引发持久的应答。我们推测，药理学阻断MMR可拓宽有资格接受免疫疗法的患者群体。在此，我们揭示MMR蛋白PMS2是一个可成药靶点，并描述了同类首创小分子MMR通路调节剂NP1867的发现与表征。体外用NP1867处理小鼠癌细胞可消除MMR功能并诱导出MMR-d基因型，包括TMB升高、MMR-d突变特征及微卫星高不稳定（MSI-H）状态。将经NP1867预处理后的癌细胞接种至同系免疫健全小鼠体内，可导致肿瘤对CPI敏感、肿瘤生长延迟及完全缓解。我们首次证明，通过药理学靶向MMR可主动重塑肿瘤-宿主关系，用于治疗目的。意义：我们报道了NP1867的发现与表征——一种选择性共价小分子PMS2抑制剂。药理学阻断PMS2导致MMR缺陷基因型，其特征为TMB升高、MMR-d突变特征富集及MSI-H状态。NP1867治疗可将免疫耐药、MMR完整的癌症转化为对CPI应答的肿瘤。参见Bernards的相关评论文章，见第1486页。



介绍

DNA错配修复（MMR）是一条高度保守的通路，通过纠正复制后发生的高保真DNA聚合酶未能通过校对功能识别的DNA碱基错配及插入/缺失（indel）环，保障基因组完整性。经典的MMR介导DNA修复是一个多步骤过程：在真核生物中，DNA错配首先由MutSα（MSH2-MSH6）或MutSβ（MSH2-MSH3）异二聚体复合物识别，随后招募MutLα（MLH1-PMS2）异二聚体（1, 2）。组装完成的MMR复合物随后获得许可，通过PMS1同源物2（PMS2）的C端内切核酸酶功能在错配位点近端的DNA子链上产生切口；随后由外切核酸酶1（EXO1）介导切除错配位点之后的新合成DNA子链，由DNA聚合酶δ（Pol δ）重新合成子链，并由DNA连接酶介导封闭切除缺口，完成修复（3, 4）。在原核生物中，MutS和MutL均为同源二聚体，标志着进化而来的真核异二聚体复合物具有功能特化。例如，虽然MLH1与PMS2形成类似原核MutL同源二聚体的异二聚体（MutLα），但MLH1也可与MLH3配对形成MutLγ，后者与三核苷酸重复障碍有关（5），还可与PMS1配对形成MutLβ，后者控制减数分裂基因转换模式（6）。与MMR的复制后修复功能一致，MMR缺陷型（MMR-d）癌症通常以随时间依赖性积累的单核苷酸变异（SNVs）和indel为特征，二者通常通过肿瘤突变负荷（TMB）共同量化。indel通常产生于微卫星背景下，微卫星是高度多态的短重复DNA序列，在复制过程中易发生滑移，导致模板链与子链之间重复单元数目不一致（7, 8）。在临床上，微卫星特异性panel的测序被常规用于对患者MMR-d肿瘤进行分类：在五个临床检测微卫星标记物中有两个或以上存在微卫星变异的癌症被定义为微卫星高不稳定（MSI-H；参考文献9）。在具有里程碑意义的临床研究之后，MMR-d肿瘤现已有资格接受检查点抑制剂（CPI）治疗，不受组织类型限制，为患者带来显著获益，是癌症治疗的一项重大进展（10–17）。相反，尽管CPI在特定肿瘤类型中具有变革性影响，但大多数MMR完整（MMR-p）、微卫星稳定（MSS）的癌症患者（尤其是结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌及某些肺腺癌）从免疫治疗中获益甚微或无获益（11, 12, 18–20）。这些肿瘤通常表现为TMB低和有限的免疫细胞浸润，所有这些因素共同导致免疫学上"冷"的微环境，因此当前的免疫治疗策略通常无法诱导持久应答（21, 22）。因此，迫切需要确定可实施的、基于机制的方法，以重塑免疫排斥并增强肿瘤抗原性（23）。我们和他人此前报道，在多种小鼠癌细胞系中通过CRISPR-Cas9敲除（KO）Mlh1或Msh2，经体外长期细胞培养后接种至同系小鼠，结果显示肿瘤在CPI治疗下被排斥（24, 25）。这些发现共同印证了一种观点，即MMR缺陷与快速分裂且持续存在的肿瘤细胞中的复制应激相结合，可引发一种已被CPI治疗预激活的免疫原性状态。值得注意的是，我们的临床前数据显示，即使仅注射含有50% MMR-d细胞的细胞群体，也观察到免疫监视现象（26）。我们推测，利用MMR通路的药理学抑制可能在治疗上具有价值，可诱发肿瘤免疫原性并将MMR-p肿瘤重编程为免疫应答状态，有望克服当今免疫肿瘤学中最持久且最具临床相关性的挑战之一。据我们所知，此前尚未报道MMR蛋白的小分子直接抑制剂。在项目启动时，尚不清楚MMR功能的药理学抑制是否：(i) 可行，(ii) 不影响细胞增殖，(iii) 产生与MMR-d患者肿瘤中观察到的基因组改变类似的变化，或(iv) 诱导免疫原性并对CPI治疗产生应答。我们选择聚焦于MutLα异二聚体搭档MLH1和PMS2，认识到它们是启动错误DNA子链切除所必需的，这一早期酶促活性是MMR依赖修复的必要条件。此外，MutLα的两种蛋白均属于解旋酶、HSP90、组氨酸激酶、MutL（GHKL）ATP酶家族，其中HSP90已作为多个药物发现项目的靶点（27）。PMS2和MLH1均含有N端ATP酶结构域（NTD）、C端二聚化结构域（CTD）和一个柔性连接结构域；PMS2的CTD（而MLH1不是）含有DNA修复所必需的内切核酸酶活性，其连接结构域含有核定位信号（28）。在此，我们报道了NP1867的发现与表征——一种同类首创的、强效且选择性的PMS2共价抑制剂，将该蛋白确立为DNA MMR通路内的一个新治疗靶点。NP1867在MMR依赖DNA修复的细胞检测中阻断MMR功能，首次证明了小分子介导的MMR功能直接抑制。小鼠癌细胞体外持续使用NP1867处理可诱导出MMR-d人类肿瘤中经典观察到的基因型特征，如高TMB、MMR-d突变特征和MSI。将经NP1867预处理的癌细胞接种至同系免疫健全小鼠后，增强了肿瘤对抗PD-1治疗的免疫原性轮廓，证明PMS2 ATP结合位点的药理学阻断可产生类似于MMR-d患者肿瘤及此前报道的细胞和体内模型的CPI应答状态（24, 25）。

结果

强效且选择性PMS2结合剂的发现

在我们项目启动时，缺乏稳健且可重复的生化检测方法来定量MutLα组分PMS2和MLH1的结合，全长人蛋白的生产也证明极具挑战性，这排除了通过高通量筛选大型化合物库来发现初始先导化合物的可能性。因此，我们推测选择性MutLα抑制剂的结构导向设计可通过以下途径实现：(i) PMS2和MLH1的ATP结合位点与GHKL家族其他成员具有相似性（补充图S1A），(ii) 大肠杆菌MutL（EcMutL）晶体结构的可获得性（29, 30），以及(iii) 先前的证据表明间苯二酚化学基团是GHKL家族成员HSP90的结合剂（31）。基于此知识，我们通过表面等离子体共振（SPR）对人MLH1和PMS2蛋白的NTD筛选了一个小型定制间苯二酚片段库。片段1通过SPR对人MLH1表现出弱结合（KD = 27.9 μmol/L；补充图S1B；补充表S1）；与EcMutL ATPase结构域解析的2.1 ?分辨率蛋白-配体共晶体结构显示，间苯二酚支架通过水介导的方式与Asp58和Ser34结合，与间苯二酚支架与HSP90的结合模式相似（补充图S1C；补充表S2，PDB ID: 9PRP；参考文献31）。我们注意到，人MutLα异二聚体组分PMS2保留了靠近ATP结合位点的Cys73（相当于EcMutL的Cys61），而人MLH1在该位置为Thr61。这一观察使得设计共价抑制剂成为可能，可选择性加合物h-PMS2的Cys73，不可逆地竞争PMS2-NTD的ATP结合。该策略需要小分子干扰PMS2-NTD ATPase功能，同时也抑制远端PMS2 CTD内切核酸酶活性和MMR功能；我们的细胞检测正是围绕这些问题设计的。通过迭代的结构导向设计，对片段1进行修饰，以靶向h-PMS2的Cys73，利用能够与半胱氨酸硫原子形成不可逆共价加合物的活性弹头，发现了NP1867（图1A–D；补充表S1）。

图1. 放大查看 下载幻灯片 NP1867与人PMS2 N端结构域结合的X射线晶体结构。A和B，NP1867（A中为粉色，B中为紫色）位于人PMS2-NTD（灰色）的ATP结合位点中，描绘了与Asp70、Gly74和Ser46的关键水介导相互作用，与Asp70和Asn45的直接氢键相互作用（洋红色虚线，水分子显示为红色球体），以及与Cys73的共价键形成（加合物碳原子上S-对映体显示在A中，R-对映体显示在B中：PDB ID: 9S89）。C，人PMS2-NTD与NP1867结合的蛋白晶体结构视图，展示了从残基Thr84到Glu109的未解析柔性区域（均以紫色突出显示）；NP1867显示为绿色，蛋白显示为灰色。D，NP1867的化学结构。

图1. 放大查看 下载幻灯片 NP1867与人PMS2 N端结构域结合的X射线晶体结构。A和B，NP1867（A中为粉色，B中为紫色）位于人PMS2-NTD（灰色）的ATP结合位点中，描绘了与Asp70、Gly74和Ser46的关键水介导相互作用，与Asp70和Asn45的直接氢键相互作用（洋红色虚线，水分子显示为红色球体），以及与Cys73的共价键形成（加合物碳原子上S-对映体显示在A中，R-对映体显示在B中：PDB ID: 9S89）。C，人PMS2-NTD与NP1867结合的蛋白晶体结构视图，展示了从残基Thr84到Glu109的未解析柔性区域（均以紫色突出显示）；NP1867显示为绿色，蛋白显示为灰色。D，NP1867的化学结构。 关闭弹窗

定量化合物对PMS2和MLH1的亲和力证明颇具挑战性；在我们手上，人重组MLH1或PMS2-NTD的ATP周转不足以稳健且可重复地定量ADP产生（32）。令人惊讶的是，我们无法检测到 commercially available 的ATP-或ADP衍生的荧光偏振（FP）检测探针与人PMS2-NTD或h-MLH1-NTD的结合。因此，我们使用从项目早期发现的配体开发的新FP探针2和3建立了FP检测（补充图S1B；补充方法S1）。NP1867对PMS2表现出强效且选择性的亲和力（补充表S1）；当FP检测以时间依赖性动力学模式运行时（见补充方法S1），FP检测数据与PMS2-NTD中Cys73预期发生共价加合物的情况一致（kinact/KI = 19,502 M?1 s?1；KI = 0.101 μmol/L且kinact = 0.002 s?1）。结合的可逆组分通过PMS2-NTD SPR进一步表征（KD = 0.065 μmol/L；补充表S1），提示了一个两步结合过程：首先可逆占据ATP结合位点，随后Cys73发生不可逆共价加合物。NP2567是NP1867的一种变体，具有结构匹配的共价弹头和支架，但间苯二酚经过修饰，消除了对PMS2的可逆结合亲和力，阻止了Cys73加合物，从而提供了一个合适的对照化合物，符合共价抑制剂表征的最新指南（补充图S1B；补充表S1；参考文献33）。为确认共价结合模式，我们获得了NP1867与PMS2-NTD复合物在2 ?分辨率下的晶体结构（图1；补充表S2，PDB ID: 9S89）。与片段1在EcMutL中的结合模式一致，间苯二酚支架通过与Asp70和Ser46形成水介导的氢键网络结合，而Asn45与C4-OH直接结合；靠近Cys73观察到的电子密度与Cys73的硫原子和弹头β碳之间共价键的存在一致；有趣的是，手性加合物的两种对映体均与观察到的电子密度一致（图1A和B）。残基Thr84到Glu109未被解析；这一柔性区域定义所谓的ATP盖子，在所有人PMS2已解析的所有结构中均呈现无序状态（图1C；参考文献34）。

这些数据表明，NP1867通过Cys73残基的加成作用与人PMS2（h-PMS2）的ATP酶结构域结合，该残基位于ATP结合位点。对NP1867在大面板选择性筛选中的分析（394种非突变激酶面板、SafetyScreen44面板以及基于细胞的ATP酶面板；参考文献35）显示，除与κ阿片受体和PDHK家族脂质激酶的结合作用外，未发现显著靶点命中（补充图S2A–S2D），后者含有与GHKL家族ATP酶相似的ATP结合位点（补充图S1A、S2A和S2B；补充表S3）。为了定量评估细胞内靶点占位率和GHKL家族选择性，我们开发了一种针对PMS2的全细胞NanoBRET靶点结合实验，该方法通过在HEK293细胞中转瞬表达全长NanoLuc标记的h-PMS2以及新型NanoBRET示踪剂4来实现（补充图S1B；补充方法S1）。在该实验中，NP1867表现出强效的PMS2结合能力（IC50 = 0.022 μmol/L；IC95 = 0.418 μmol/L），而在相应的NanoBRET实验中未观察到对MLH1或Hsp90的结合（补充表S1）。随后，我们用3 μmol/L的NP1867处理SW620人类结直肠癌细胞，并通过基于细胞的蛋白质组学定量分析半胱氨酸组加成。唯一可检测到的加成半胱氨酸是PMS2的Cys73，证实了NP1867的卓越选择性（补充图S3）。综上所述，NP1867在体外激酶、体外安全性和基于细胞的GHKL家族NanoBRET实验以及ATP酶面板筛选结合基于细胞的半胱氨酸组分析中表现出的清晰特征，可确信地表明NP1867特异性靶向PMS2的Cys73。细胞PMS2的浓度和时间依赖性加成

为了更好地表征NP1867在细胞中对PMS2的时相关靶点结合，我们利用了一个在Western blot检测PMS2时发现的有趣现象：在用SDS-PAGE分离还原的全细胞裂解液后，与NP1867不可逆加成的PMS2比未加成的PMS2迁移速度更快，导致条带位移；这种半定量方法在CT26小鼠结直肠肿瘤细胞和TS/A乳腺腺癌细胞中显示PMS2靶点结合具有浓度和时间依赖性（图2A；补充图S4）。我们还开发了一种平行反应监测质谱（PRM-MS）方法来稳健地定量细胞内PMS2靶点结合。经AspN/胰蛋白酶双重消化后，质谱可检测到含未加成Cys73的20个氨基酸残基肽段。在用NP1867处理CT26细胞后，我们观察到未加成PMS2 Cys73肽段出现可定量的减少（图2B）。通过Western blot条带位移和PRM-MS方法比较加成形成，结果显示两种方法在PMS2靶点结合的浓度和时间依赖性变化上高度一致（图2A和B）。在人单倍体HAP1细胞和人SW620结直肠癌细胞中也观察到人PMS2的时间依赖性加成（图2C和D）；无活性对照化合物NP2567如预期所示未能与PMS2加成（图2A–D）。图2.（点击查看大图/下载幻灯片）通过条带位移分析和PRM-MS在人及小鼠癌细胞系中监测NP1867对PMS2的靶点结合。A和B，CT26小鼠细胞用指示浓度的NP1867或1 μmol/L的NP2567处理2、4、8或24小时。NP1867对PMS2的靶点结合通过以下方式监测：A，定制的Western blot方法检测PMS2条带位移，或B，PRM-MS定量未加成Cys73 PMS2肽段相对于未加成对照肽段（DMSO）的含量。B中每种颜色对应加成Cys73含PMS2肽段的不同分子离子，n = 1次实验。C，HAP1细胞和D，SW620人细胞分别用NP1867处理15、30、60和120分钟，或用0.3 μmol/L的NP2567处理120分钟；PMS2靶点结合通过PMS2条带位移Western blot进行评估。（关闭弹窗）

PMS2敲除消除MMR依赖性功能

在无DNA损伤的情况下，MMR活性极低；因此，定量评估基线MMR活性的降低具有挑战性。我们因此使用已知的MMR依赖性DNA损伤剂6-硫鸟嘌呤（6-TG）和替莫唑胺（TMZ）来证明MMR功能受到抑制。例如，为了了解仅药理学阻断PMS2是否足以消除MMR功能，我们开发了一种机制性基于细胞的实验，利用PMS2敲除细胞模型定量评估6-TG诱导的DNA错配特异性修复。流式细胞术末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记法（TUNEL）用于定量荧光素（FITC）标记的dUTP掺入到单链断裂（SSB）游离3′-OH末端的过程，使用等基因单倍体HAP1细胞系[野生型（WT）和PMS2敲除]；重要的是，CRISPR介导的PMS2缺失不影响MLH1蛋白水平（图3A）。用与72小时细胞活力实验中EC50值相对应的浓度，以嘌呤类似物6-TG处理WT-HAP1细胞48小时后，诱导了与MMR特异性修复启动一致的DNA损伤（参考文献36），而对PMS2-CRISPR-Cas9敲除HAP1细胞的处理则显示背景水平的DNA SSB（图3B），表明PMS2的缺失消除了MMR依赖性修复的启动。图3.（点击查看大图/下载幻灯片）PMS2敲除诱导MMR缺陷表型，其特征为对6-TG的耐受性。A，通过JESS（自动化Western印迹）在HAP1 WT PMS2表达细胞或PMS2敲除细胞中检测MMR蛋白MLH1和PMS2及微管蛋白的表达。B和C，HAP1 WT表达细胞或PMS2敲除细胞用（+）或不加（?）1 μmol/L的6-TG处理48小时（B）或0.8 μmol/L的6-TG处理72小时（C）。B，通过TUNEL检测具有DNA链断裂的细胞；dUTP在DNA链断裂游离3′-OH末端的掺入。通过流式细胞术测量dUTP阳性细胞的百分比。n = 75次实验。数据以每次实验获得的个体值（圆圈）和平均值（水平线）±标准误（SEM）展示。统计分析：单因素方差分析后接Tukey检验。C，通过流式细胞术测量细胞周期阶段。n = 4次实验。平均值±SEM。统计分析：双尾t检验。ns，无显著性差异；***，P < 0.001。（关闭弹窗）

对6-TG处理的耐受性是MMR缺陷的重要细胞特征（参考文献36）。我们使用等基因HAP1细胞对监测细胞群体的增殖指数，包括6-TG处理后48小时处于S期的健康6-TG耐受细胞与经历G2/M细胞周期停滞的受损细胞的相对百分比。用6-TG处理WT-HAP1细胞后，如预期般出现了S期细胞百分比的降低和G2/M期细胞百分比的相应增加；相比之下，在PMS2敲除细胞中未观察到6-TG对细胞周期进程的影响（图3C），这与对6-TG的耐受性是MMR缺陷特异性特征一致。总之，这些数据表明仅PMS2的缺失就足以消除基于细胞的MMR功能。NP1867占据PMS2 ATP位点抑制MMR功能

为了了解NP1867与PMS2-NTD ATP位点的结合以及随后的ATP竞争是否能消除MMR功能，我们在等基因HAP1 WT和PMS2敲除细胞中检测了NP1867对6-TG诱导的MMR依赖性反应的影响。重要的是，在能最大程度结合PMS2的浓度下，NP1867对HAP1细胞不具细胞毒性（GI50 = 15.4 μmol/L，补充表S1）。NP1867与6-TG共处理WT-HAP1细胞导致MMR依赖性DNA SSB的剂量依赖性抑制（EC50 = 0.043 μmol/L），最大抑制效果等同于PMS2敲除（图4A），这与NP1867占据PMS2-NTD ATP结合位点会消除PMS2-CTD核酸内切酶功能的概念一致。对照化合物NP2567无活性（EC50 > 10 μmol/L），且在不加6-TG的情况下，无论是用NP1867还是NP2567处理WT-HAP1细胞或PMS2 CRISPR-Cas9敲除细胞均无效果，这与MMR依赖性作用机制一致（图4B）。NP1867还降低了经历6-TG诱导的MMR依赖性细胞周期停滞（G2/M细胞群体）的HAP1细胞百分比，并将处于S期的增殖细胞百分比恢复至未经6-TG处理的细胞水平。该功能性实验中的效力与NanoBRET靶点结合实验和6-TG诱导的DNA SSB机制性实验一致：EC50 S期细胞百分比 = 0.035 μmol/L；G2/M期细胞百分比 = 0.043 μmol/L（图4C）。值得注意的是，在该实验中NP1867的高浓度效应并未超过PMS2单独敲除的效果；例如，在6-TG处理HAP1 PMS2敲除细胞后，我们观察到55%的细胞处于S期（图3C）；在6-TG与NP1867共处理时，我们也观察到55%的HAP1 WT细胞处于S期（图4C），进一步支持NP1867的靶点特异性。除6-TG挑战后48小时的细胞周期功能性读出外，我们在6-TG损伤后72小时使用安克西林V定量了凋亡反应。NP1867但非无活性对照NP2567能够逆转6-TG诱导的MMR依赖性凋亡（图4D；补充图S5A）。图4.（点击查看大图/下载幻灯片）PMS2抑制诱导MMR缺陷表型，其特征为对6-TG的耐受性和对TMZ的耐药性。A–D，HAP1 WT表达细胞或PMS2敲除细胞用或不加6-TG，以1 μmol/L的6-TG处理48小时（A、B和D）或以0.8 μmol/L的6-TG处理72小时（C）。除6-TG处理外，细胞还用指示化合物（NP1867或NP2567）处理，在6-TG处理前24小时以指示浓度加入。A和B，通过TUNEL检测具有DNA链断裂的细胞；dUTP在DNA链断裂游离3′-OH末端的掺入。通过流式细胞术测量具有DNA链断裂（dUTP阳性）的细胞百分比。A，n = 4次实验。B，在WT细胞中，6-TG + NP2567：n = 3次实验。在PMS2敲除细胞中，6-TG + NP2567：n = 1次实验。在WT和PMS2敲除细胞系中，不加6-TG + NP1867或+ NP2567：n = 2次实验。数据以每次实验获得的个体值（圆圈）和平均值（水平线）±SEM展示。C，通过流式细胞术测量细胞周期阶段。n = 4次实验。D，HAP1-WT细胞与1 μmol/L的6-TG和不同浓度的NP1867共处理72小时。通过Incucyte检测安克西林V阳性凋亡细胞。n = 3次实验。E，人SW620结直肠癌细胞与25 μmol/L的TMZ和指示浓度的NP1867共处理4天。通过Incucyte检测安克西林V阳性凋亡细胞。n = 3–5次实验。F，小鼠CT26结直肠癌细胞单独用10 μmol/L的NP1867（不加6-TG）或用25 nmol/L的6-TG（6-TG）和指示浓度的NP1867、30 μmol/L的阴性对照NP2567或溶剂对照（DMSO）处理7天。通过Incucyte活细胞成像测量倍增时间。n = 3–4次实验。G和H，小鼠CT26细胞用（+）或不加（?）0.5 μmol/L的6-TG以及DMSO、NP2567或1 μmol/L的NP1867处理7天。在第7天，细胞被固定并用CellTag700进行荧光标记。

G，整个24孔板代表性图片。H，使用Odyssey成像系统（LI-COR Biosciences）进行荧光检测，n = 3组实验。B–H，数据以均值±标准误（SEM）表示，除非另有说明。统计分析：双尾t检验。ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。

**图4** 放大显示 下载幻灯片

PMS2的抑制诱导MMR-d表型，其特征为对6-TG的耐受和 TMZ抗性。A–D，HAP1 WT表达细胞或PMS2 KO细胞接受或不接受（无6-TG）1 μmol/L 6-TG处理48小时（A、B和D）或0.8 μmol/L 72小时（C）。除6-TG处理外，细胞还接受指定化合物（NP1867或NP2567）处理，在6-TG处理前24小时以指定浓度加入。A和B，通过TUNEL检测DNA链断裂；dUTP掺入DNA链断裂的游离3′-OH末端。通过流式细胞术测量DNA链断裂（dUTP阳性）细胞的百分比。A，n = 4组实验。B，在WT细胞中，6-TG + NP2567：n = 3组实验。在PMS2 KO细胞中，6-TG + NP2567：n = 1组实验。在WT和PMS2 KO细胞系中，无6-TG + NP1867或+ NP2567：n = 2组实验。数据以每组实验获得的个体值（圆形）和均值（横线）± SEM表示。C，通过流式细胞术测量细胞周期阶段。n = 4组实验。D，HAP1-WT细胞与1 μmol/L 6-TG和不同浓度的NP1867共同处理72小时。Annexin V阳性凋亡细胞通过Incucyte检测。n = 3组实验。E，人SW620结直肠癌细胞与25 μmol/L TMZ和指定浓度的NP1867共同处理4天。Annexin V阳性凋亡细胞通过Incucyte检测。n = 3–5组实验。F，小鼠CT26结直肠癌细胞单独用10 μmol/L NP1867（无6-TG）或用25 nmol/L 6-TG（6-TG）和指定浓度的NP1867、阴性对照NP2567（30 μmol/L）或溶剂对照（DMSO）处理7天。通过Incucyte活细胞成像测量倍增时间。n = 3–4组实验。G和H，小鼠CT26细胞接受或不接受0.5 μmol/L 6-TG（+或?）以及DMSO、NP2567或1 μmol/L NP1867处理7天。第7天，细胞固定并用CellTag700荧光标记。G，整个24孔板代表性图片。H，使用Odyssey成像系统（LI-COR Biosciences）进行荧光检测，n = 3组实验。B–H，数据以均值± SEM表示，除非另有说明。统计分析：双尾t检验。ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。关闭模态框

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除了对6-TG的耐受性，对DNA甲基化剂TMZ的耐药性是MMR缺陷的一个重要且独特的细胞标志。NP1867（而非NP2567）能够在O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）缺失的人SW620细胞中通过Annexin V功能测定逆转TMZ驱动的MMR依赖性细胞死亡（图4E；补充图S5B–S5D；补充视频S1）。总之，这些MMR依赖性细胞测定表明，（i）PMS2功能丧失（KO）和（ii）NP1867对PMS2 ATP结合位点的强效和选择性占据，同样足以使人类细胞中的MMR功能失活。作为评估用NP1867处理的肿瘤细胞引发免疫反应的潜力的前提，我们使用CT26小鼠结直肠癌细胞研究了MMR抑制的功能后果，该细胞可在同基因小鼠中形成肿瘤（24）。MMR依赖性DNA修复不可避免地导致细胞周期延迟，特别是在S期，这可以通过细胞倍增时间来监测。用非细胞毒性浓度的6-TG处理的小鼠CT26细胞（补充图S5E）因MMR依赖性修复6-TG诱导的DNA损伤而显示加倍时间增加；与NP1867共同处理以剂量依赖方式抑制修复并将加倍时间恢复至DMSO处理细胞的水平（图4F；补充图S5E）。用NP1867处理还保护小鼠细胞免受6-TG诱导的细胞毒性，引发6-TG耐受性。在小鼠CT26细胞和TS/A细胞中，用DMSO或NP2567处理的细胞暴露于细胞毒性浓度的6-TG时会导致大量细胞死亡，以细胞密度和CellTag 700信号显著降低为证。相反，NP1867与6-TG共同处理使CT26和TS/A细胞模型从6-TG诱导的凋亡中挽救（图4G和H；补充图S5F和S5G）。总之，这些数据表明NP1867在人和小鼠细胞模型中抑制MMR活性而不影响细胞增殖。我们的观察强调了PMS2作为MMR功能关键可成药组分的意义，并重要的是，证明了NP1867阻断PMS2-NTD ATP结合位点在机制和功能细胞测定中抑制DNA MMR。

## NP1867对PMS2的抑制导致癌细胞中出现MSI-H状态和MMR-d突变特征

在获得了一种强效、选择性且非细胞毒性的MMR共价小分子抑制剂，并了解了NP1867对PMS2加合物形成的浓度和时间依赖性后，我们首次得以探索慢性药物性MMR抑制的后果。伴随着肿瘤突变负荷（TMB）升高，缺乏功能性MMR的癌症通常表现出独特的基因型特征，包括MSI-H状态和特定的SBS突变特征（通常为SBS6、14、15、20、21、26和44），这源于细胞复制过程中MMR活性被禁用（37，38）。我们评估了用NP1867处理是否会导致小鼠癌细胞中出现MMR-d分子特征。NP1867在0.5 μmol/L浓度下测试（NanoBRET基于细胞的靶点结合测定的IC95值，补充表S1），该浓度在CT26细胞中24小时内即可显示接近完全的PMS2占据（图2A和B）。在CT26细胞中用0.5 μmol/L NP1867或DMSO进行三重复生物学重复的延长处理10个周期（每周期4周）后，我们观察到无细胞毒性、无MMR组分表达变化，以及实验结束时（T10）NP1867的完全靶点结合（补充图S6A）。全外显子组测序（WES）和计算分析显示，SNV积累驱动的TMB随时间依赖性增加（图5A；补充图S6B和S6C；补充表S3），每个NP1867处理生物学重复获得的独特突变数量与DMSO处理组相比有所增加（图5B），以及MSI-H状态的时间依赖性获得，这是MMR-d细胞中渐进出现的经典标志（图5C）。对突变获得的定性分析显示，NP1867处理细胞中特定富集了以C > T和T > C转换为特征的MMR-d突变特征，特别是SBS15和SBS21，而DMSO处理细胞中未见此现象（图5D和E；补充图S6D）。这些数据表明，NP1867长期占据PMS2 ATP结合位点不具有细胞毒性，并导致通常存在于MMR-d患者样本中的基因型特征，为进一步证实MMR的强效和选择性抑制提供了证据。

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NP1867处理导致与COSMIC MMR-d突变特征相关的基因型变化。小鼠CT26细胞在生物学三重复条件下用DMSO（溶剂对照）或0.5 μmol/L NP1867处理最多10个周期（T10，每周期4周）。与实验开始时相比，分析4（T4）、6（T6）、8（T8）和10（T10）个周期的处理结果：（A）TMB（SNV + Indels），表示为获得的突变数/Mb，（B）每个时间点每个重复和每个处理组（DMSO或NP1867）获得的独特突变数量，以及（C）MSI评分分析。红色虚线标示了MSI-H状态的阈值（25）。A和C，数据以箱线图（中位数、IQR、最小值和最大值）表示；B以均值± SEM表示。A–C，统计分析：双尾t检验。ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。D，T10时每臂一个代表性重复的获得SNV的突变谱。E，NP1867处理细胞的突变特征分析，显示与MMR-d相关的突变特征COSMIC SBS15和COSMIC SBS21随时间富集。A–E，数据以n = 3个重复的均值± SEM表示。

**图5** 放大显示 下载幻灯片

NP1867处理导致与COSMIC MMR-d突变特征相关的基因型变化。小鼠CT26细胞在生物学三重复条件下用DMSO（溶剂对照）或0.5 μmol/L NP1867处理最多10个周期（T10，每周期4周）。与实验开始时相比，分析4（T4）、6（T6）、8（T8）和10（T10）个周期的处理结果：（A）TMB（SNV + Indels），表示为获得的突变数/Mb，（B）每个时间点每个重复和每个处理组（DMSO或NP1867）获得的独特突变数量，以及（C）MSI评分分析。红色虚线标示了MSI-H状态的阈值（25）。A和C，数据以箱线图（中位数、IQR、最小值和最大值）表示；B以均值± SEM表示。A–C，统计分析：双尾t检验。ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。D，T10时每臂一个代表性重复的获得SNV的突变谱。E，NP1867处理细胞的突变特征分析，显示与MMR-d相关的突变特征COSMIC SBS15和COSMIC SBS21随时间富集。A–E，数据以n = 3个重复的均值± SEM表示。关闭模态框

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## NP1867预处理使结直肠癌肿瘤在体内对抗PD-1治疗产生应答

为了进一步深入理解PMS2作为免疫肿瘤学药物靶点的作用，我们探讨了CT26细胞在慢性NP1867处理后观察到的基因型变化是否足以增加其免疫原性。将三生物学重复的NP1867处理或DMSO处理的CT26细胞以等比例混合后皮下接种于免疫健全（BALB/c）同基因小鼠中；在抗PD-1治疗或相应同型对照存在下监测肿瘤生长（图6；补充图S7A–S7D）。NP1867处理的CT26细胞在体内显示出对抗PD-1治疗敏感性增加（图6A；补充图S7A和S7B）。值得注意的是，在缺乏CPI治疗的情况下，NP1867处理和DMSO处理的CT26细胞在免疫健全小鼠中生长相似（图6A和B；补充图S7A和S7C）；因此，慢性NP1867处理CT26细胞在无抗PD-1治疗的情况下未赋予免疫原性。NP1867处理和DMSO处理的CT26细胞在NOD.SCID小鼠中的生长相当（补充图S7E–S7G），表明NP1867处理的CT26细胞在无健全免疫系统时不表现出体内生长缺陷。

**图6** 放大显示 下载幻灯片

NP1867慢性处理使小鼠CT26肿瘤细胞在体内对抗PD-1治疗产生敏感性。A–F，小鼠CT26细胞在体外用0.5 μmol/L NP1867或DMSO处理10个周期（T10，每周期4周）。A和B，在免疫健全BALB/c小鼠中NP1867处理（A）和DMSO处理（B）的CT26 T10细胞肿瘤生长曲线（每组n = 20只小鼠），在同型对照或抗PD-1治疗存在下。标注有黑色箭头的黑色虚线表示同型对照或抗PD-1治疗的时间。肿瘤体积以均值± SEM表示，直至每组70%的动物仍在研究中。统计检验：经Holm–?ídák校正的非参数Mann–Whitney检验。C和D，来自A和B的卫星肿瘤（每组n = 6只小鼠）中总TIL（C）和T细胞（D）的细胞类型分析评分，基于NanoString泛癌症免疫分析面板通过特定基因标记物对每种细胞的表达进行分析。统计分析：单因素方差分析后接Tukey多重比较检验。数据以箱线图（中位数、IQR、最小值和最大值）表示。E，NanoString泛癌症免疫分析面板中所有29个预定义免疫相关基因集的通路评分热图，比较A和B中所有四组卫星肿瘤（每组n = 6只小鼠）的通路活性水平（DMSO处理T10细胞肿瘤接受同型对照或抗PD-1（aPD-1）治疗，NP1867处理T10细胞肿瘤接受同型对照或抗PD-1治疗）。F，来自补充图S8A卫星动物（每组n = 6只小鼠）肿瘤中NanoString泛癌症免疫分析面板预定义免疫相关通路的GSA显著性评分。

GSA显著性评分为以下比较计算得出：(i) 接受抗PD-1与同型对照治疗的NP1867 T10肿瘤与基线相比（绿色圆点/线），以及(ii) 接受抗PD-1与同型对照治疗的DMSO T10肿瘤与基线相比（黑色圆点/线）。图中展示了29个预定义通路中GSA显著性评分最高的前10个通路。ns，无统计学显著性差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。DC，树突状细胞。

图6 慢性NP1867处理使小鼠CT26肿瘤细胞在体内对抗PD-1治疗产生增敏作用。A–F，小鼠CT26细胞在体外接受0.5 μmol/L NP1867或DMSO处理10个周期（每周期4周，T10）。A和B，在免疫正常的BALB/c小鼠中，NP1867处理的（A）和DMSO处理的（B）CT26 T10细胞的肿瘤生长曲线（n = 20只/组），分别给予同型对照或抗PD-1治疗。带有黑色箭头的黑色虚线标注了同型对照或抗PD-1治疗的给药时间。肿瘤体积以均值±SEM表示，直至每组70%的动物仍在研究中。统计检验：经Holm–?ídák校正的非参数Mann–Whitney检验。C和D，基于A和B中卫星肿瘤（n = 6只/组）的总肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）（C）和T细胞（D）的细胞类型特征评分，通过NanoString泛癌免疫谱分析面板中各细胞特异性基因标志物的表达得出。统计分析：单因素方差分析后接Tukey多重比较检验。数据以箱线图表示，包含中位数、四分位距（IQR）、最小值和最大值。E，NanoString泛癌免疫谱分析面板中所有29个预定义免疫相关基因集的路径评分热图，比较A和B中四组卫星肿瘤（n = 6只/组）的路径活性水平[DMSO处理的T10细胞肿瘤接受同型对照或抗PD-1（aPD-1）治疗，以及NP1867处理的T10细胞肿瘤接受同型对照或抗PD-1治疗]。F，NanoString泛癌免疫谱分析面板中卫星动物肿瘤（n = 6只/组）的预定义免疫相关通路的GSA显著性评分，来自补充图S8A。GSA显著性评分为以下比较计算得出：(i) 接受抗PD-1与同型对照治疗的NP1867 T10肿瘤与基线相比（绿色圆点/线），以及(ii) 接受抗PD-1与同型对照治疗的DMSO T10肿瘤与基线相比（黑色圆点/线）。图中展示了29个预定义通路中GSA显著性评分最高的前10个通路。ns，无统计学显著性差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001。DC，树突状细胞。

接种了NP1867处理或DMSO处理CT26细胞的动物，代表总体平均组肿瘤体积，在第四次也是最后一次抗PD-1或同型对照给药后24小时作为卫星组被移出实验进行肿瘤取样（补充图S8A）。我们评估了适应性免疫和固有免疫反应的基因表达谱：接受抗PD-1体内治疗的小鼠中，NP1867处理的CT26肿瘤表现出更高的总肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、T细胞和细胞毒性细胞水平（图6C和D；分别见补充图S8B和S8C），与同型对照和DMSO处理的肿瘤相比。为了评估通路水平上对抗PD-1的协调基因表达变化，我们计算了汇总预定义基因集表达的通路评分（图6E）。与DMSO处理的对照相比，NP1867预处理CT26肿瘤在体内接受抗PD-1治疗后显著富集多个免疫相关通路，包括适应性免疫、抗原加工与呈递、主要组织相容性复合体（MHC）信号传导、T细胞和自然杀伤（NK）细胞功能以及干扰素反应等通路（图6E）。值得注意的是，抗原加工和MHC信号通路在NP1867处理的肿瘤中对抗PD-1反应时显著上调（补充图S8D），表明体外NP1867预处理为CT26肿瘤细胞增强免疫激活做好了准备，从而提高了抗PD-1治疗的疗效。这与在肿瘤植入前体外生物学重复实验中观察到的NP1867处理CT26细胞MHC I类分子（H-2 I类分子）和NK激活配体H60表达增加的结果一致（分别见补充图S8E和S8F）。NP1867处理的肿瘤在体内对抗PD-1治疗的更强烈反应也通过条件特异性比较分析得到了进一步证实。对接受抗PD-1处理的NP1867和DMSO处理的肿瘤与各自接受同型对照处理基线之间的差异基因表达进行基因集分析（GSA），为两种条件分别获得每个定义通路的显著性评分（图6F；补充图S8G）。与DMSO处理的对照肿瘤相比，NP1867预处理的CT26肿瘤在体内对抗PD-1治疗表现出更强的免疫反应，在补体通路以外的所有通路中GSA显著性评分均更高（图6F；补充图S8G）。NP1867预处理增强了CT26肿瘤的免疫反应性，表现为抗PD-1治疗后GSA显著性评分增加，表明慢性PMS2抑制所导致的MMR缺陷基因型变化可以促进肿瘤对CPI治疗的免疫敏感性。

NP1867处理小鼠乳腺癌细胞引发MMR缺陷并在体内对抗PD-1治疗产生增敏作用

为了验证并将我们的发现扩展到额外的肿瘤类型，我们选择了小鼠乳腺癌细胞系TS/A。TS/A细胞持续暴露于0.5 μmol/L NP1867后进行全外显子测序和计算分析，结果显示TMB随时间依赖性增加（补充图S9A–S9C；补充表S3），与DMSO处理的细胞相比，NP1867处理的细胞中逐渐积累具有SBS21和SBS26等MMR缺陷相关突变特征的突变，其特征为T > C转换（补充图S9D–S9I），以及MSI评分增加（补充图S9J）。综合这些数据表明，慢性NP1867抑制PMS2可诱导不同肿瘤类型中肿瘤基因型变化，包括MMR缺陷肿瘤的特征性突变谱。为评估TS/A细胞中获得MMR缺陷基因型特征是否转化为功能性免疫学后果，我们将预处理了六个周期（每周期4周，T6）的TS/A细胞（分别用NP1867或DMSO处理）原位接种至BALB/c同系小鼠乳腺脂肪垫。在免疫正常动物中，给予抗PD-1抗体或相应同型对照治疗后，对肿瘤生长进行纵向评估。在NOD.SCID小鼠中，NP1867处理的细胞来源的肿瘤与DMSO处理的细胞来源的肿瘤相比观察到轻微的肿瘤生长延迟（补充图S10A–S10C）。NP1867预处理的TS/A细胞来源的肿瘤在接受抗PD-1治疗时表现出较同型对照治疗减少的肿瘤生长（补充图S10D–S10F），而DMSO处理的对照TS/A细胞来源的肿瘤在抗PD-1和同型对照治疗之间无明显差异（补充图S10G–S10I）。

讨论

免疫检查点抑制剂被批准用于MMR缺陷恶性肿瘤患者，无论其组织类型和胚系/体细胞来源如何，这已彻底改变了数十万患者的临床结局（1, 10, 17）。最近，对非转移性MMR缺陷直肠癌和结直肠癌采用CPI作为一线治疗在大多数患者中显示出显著疗效（完全缓解），无需标准放化疗，最重要的是也无需手术（15–17）。一种普遍观点是，MMR缺陷肿瘤因突变逐步积累而表现出高TMB，这些突变经转录和翻译后产生新的新抗原，从而形成免疫活跃且对CPI应答的环境。MSI刻画了由重复基因组区域DNA复制错误引起的微卫星改变，在复制后依赖MMR的修复缺失时会不断积累；MSI-H是CPI应答性的替代临床生物标志物（1, 7, 39）。遗憾的是，大多数人类癌症，包括胰腺癌、前列腺癌和大多数结直肠肿瘤，是MMR修复正常的，对CPI治疗无应答（1）。本工作旨在创建一类新型分子，将MMR修复正常转化为潜在具有免疫原性的MMR缺陷肿瘤，为许多免疫难治性人类癌症开辟新的治疗途径。基于这一目标，我们着手发现DNA MMR机制能否被小分子抑制，从而开展MMR缺陷时间依赖性后果的研究。药物发现计划需要确定既能被药物化的"正确"MMR靶点，又要以"正确"的方式进行药物化，使处理后的细胞继续分裂、增殖并积累突变（潜在新抗原）。在本研究中，我们首次证明，通过靶向PMS2-NTD ATP结合位点可以抑制MMR机制，同时消除PMS2 CTD核酸内切酶活性和MutLα功能，从而确立PMS2为可药物化靶点。小分子NP1867通过Cys73的加成不可逆地结合PMS2的ATP结合位点；广泛的体外和基于细胞的特异性分析，包括半胱蛋白质组学，显示其脱靶结合极小。NP1867异常高的特异性可能由选择性地可逆结合PMS2 ATP位点所驱动，该结合最佳定位共价弹头使其被Cys73加成，以及存在相对不活泼的共价弹头以减少跨半胱蛋白质组的混杂加成。小鼠细胞系长期NP1867处理未显示细胞毒性，降低了选择性压力下产生耐药机制的可能性；与此一致的是，慢性细胞处理下Cys73被NP1867完全加成得以维持。从治疗相关性来看，长期NP1867处理细胞后基因组MMR缺陷特征的出现表明，慢性PMS2抑制不会启动补偿性修复途径来纠正依赖MMR的错误。考虑到化学探针发现和分析中新兴的最佳实践（40），包括关于共价化学工具的最新指导（33），我们制备并分析了结构匹配的无活性对照NP2567，其含有与NP1867相同的弹头和骨架，但缺少PMS2特异性的间苯二酚药效团。NP2567无活性类似物的结果结合NP1867的动力学数据，进一步增强了我们的信心：NP1867与PMS2的结合需要初始可逆性ATP位点结合，随后形成不可逆加合物。基于这些信息，我们应用Western blot和PRM-MS方法定量细胞中PMS2靶点占据情况，并选择适当的化合物浓度以维持和研究长期PMS2抑制。PRM-MS检测有潜力在临床前和临床中监测任何一类共价抑制剂对PMS2靶点的占据情况。NP1867消除低剂量6-TG诱导的依赖MMR的DNA单链断裂并降低增殖率。与已建立的MMR组分基因丢失细胞对6-TG或TMZ的耐受性一致（36, 41, 42），我们发现NP1867药理学抑制PMS2也能抑制高浓度6-TG或TMZ在人和小鼠癌细胞中诱导的细胞凋亡。此外，长期NP1867处理小鼠CT26细胞诱导突变积累，包括与患者MMR缺陷癌症组织样本相似的突变谱（37, 38），并促进向MSI-H表型转化。最后，我们的观察表明，体外持续暴露小鼠癌细胞于NP1867不会影响肿瘤在免疫缺陷小鼠中注射后的肿瘤生长。相反，PMS2抑制使CT26结直肠癌细胞在注射到免疫正常小鼠后对抗PD-1治疗产生增敏作用，增加总体免疫浸润和激活，导致肿瘤生长减少。我们在抗PD-1治疗后观察到NP1867预处理肿瘤中总TIL浸润增加，尤其是T细胞，表明适应性免疫反应更强。重要的是，通路水平分析揭示NP1867预处理肿瘤对抗PD-1反应时免疫相关基因集显著上调，包括抗原加工和MHC信号通路；比较基因集分析进一步表明，与载体对照肿瘤相比，NP1867预处理肿瘤在对抗PD-1反应中几乎所有通路均表现出更强的免疫激活。为验证这些发现，我们研究了第二个小鼠模型——免疫难治性的自发性乳腺癌细胞系TS/A。TS/A细胞持续NP1867处理导致TMB进行性增加，富含标志性MMR相关突变特征和升高的MSI评分。与CT26肿瘤中的观察一致，体外NP1867预处理使TS/A原位肿瘤对抗PD-1治疗产生增敏作用，显著减少肿瘤生长。PMS2依赖于与MLH1形成异源二聚体来维持其稳定性；迄今为止，尚不清楚归属为MLH1丢失的基因型和表型（例如对抗PD-1治疗的优异临床反应）是与MLH1丢失、PMS2丢失还是两者均有关联。

本研究所呈现的观察结果与以下观点一致：(i) 小分子阻断PMS2的ATP结合位点会导致DNA错配修复（MMR）通路抑制，(ii) MLH1蛋白缺失的下游后果可能由已知的PMS2同步缺失所驱动，(iii) 重要的是，此处揭示的针对可药物化PMS2 ATP结合位点的小分子阻断，在治疗背景下可能足以抑制MMR。此前从未尝试过药理学阻断DNA MMR修复，我们承认仍有若干方面需要评估。例如，需要确定在小鼠体内需要多长时间的治疗才能在体内诱导出MMR缺陷（MMR-d）基因型，以及在用PMS2抑制剂预处理的小鼠中抗PD-1挑战的耐受性。是否还需要与抗CTLA-4药物联合以克服髓源免疫抑制，也值得进一步研究(43)。我们还想强调一些转化医学方面的考量；例如，持续PMS2抑制对正常快速分裂细胞基因组完整性的影响。林奇综合征导致肿瘤特异性MMR基因功能的纯合缺失，而先天MMR缺陷则表现为所有组织中MMR基因（最常见为PMS2）的生殖系纯合缺失；这些患者发育正常，但癌症发生率增加；然而，其肿瘤对CPI治疗也有反应(44)。由于MMR主要纠正逃逸高保真聚合酶校对功能的复制后DNA错误，我们认为快速分裂和持续存在且承受持续DNA损伤的细胞最依赖MMR活性来维持基因组完整性：即肿瘤细胞。对于进展性难治性恶性肿瘤且预期寿命较短的患者，预期的治疗获益可能超过理论风险。一种增强治疗窗的方法可以是对PMS2抑制剂进行肿瘤靶向，例如通过共价连接至癌症特异性抗体。肿瘤靶向PMS2抑制剂可能诱发耐药肿瘤克隆选择的风险，可通过MMR-d肿瘤患者长期随访中使用CPI治疗所观察到的持久缓解来缓解。总体而言，充分探索PMS2抑制的治疗潜力需要发现适用于体内长期给药的生物利用度良好的化合物，以及使用能够允许足够治疗时间以在口服PMS2抑制后出现MMR-d基因型和表型的荷瘤动物模型。遗憾的是，由于有限的代谢稳定性，NP1867不适合口服体内给药，静脉给药时清除率高，需要进行进一步优化以发现适合体内长期使用的化合物。最近探索替莫唑胺（TMZ）在MGMT阴性结直肠癌患者中的临床试验表明，TMZ通过甲基化MSH2/MSH6启动子介导MMR功能缺失，随后对CPI治疗产生反应(42, 45)，这与MMR功能缺失加速向免疫原性状态进展的假说一致。此外，顺铂与TMZ联合治疗可影响MMR功能，从而重塑小鼠临床前模型中的突变景观，当肿瘤接种至免疫健全小鼠时可引发免疫监视(46, 47)。重要的是，与TMZ不同，NP1867在细胞中抑制PMS2所需浓度的30倍下不引起细胞毒性，这为在目前无反应的患者人群中促进CPI反应提供了另一种机会；这种缺乏细胞毒性的特性可能使其能够与标准治疗方案或靶向治疗联合。总之，我们首次展示了一种DNA MMR通路的小分子抑制剂，该抑制剂与PMS2的ATP结合位点共价结合且不产生细胞毒性。我们通过机制和功能实验证明PMS2抑制的有效性，这些实验显示DNA MMR通路抑制并随之诱导TMB增加，包括与患者MMR-d肿瘤活检中观察到的类似的MMR-d突变特征。此外，与这些基因型改变相关，我们报道在体外长期用NP1867处理可使小鼠癌细胞系在同基因模型中接种后产生免疫原性，表现为抗PD-1治疗后肿瘤生长延迟。我们的发现表明，将免疫难治性癌细胞转化为免疫治疗的靶标是可行的。这为作用于癌细胞但不局限于限制肿瘤生长能力，而是主动重构肿瘤与宿主的免疫关系以达到治疗目的的药物性因素开辟了机会。这种治疗干预原则重现了MMR-d肿瘤的脆弱性，并支持了基于临床中观察到的MMR-d肿瘤对CPI的显著反应而设计的合理联合治疗。

方法

试剂列于补充资源表S1中。细胞培养

表达野生型PMS2或PMS2敲除的HAP1细胞购自Horizon Discovery。TS/A细胞由都灵大学分子生物技术中心F. Cavallo惠赠。其他所有细胞系均购自ATCC（LGC）。传代操作按照供应商的建议进行。简要而言，细胞系在所需培养基（HAP1：IMDM，SW620：DMEM-F12，CT26：RPMI 1640，TS/A：高糖DMEM）中培养，补充10% v/v胎牛血清（FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺和非必需氨基酸，并在37°C、5% CO2的湿润培养箱中增殖。当细胞达到80%汇合度时，每周传代两到三次。细胞最多维持12代传代，随后丢弃并解冻新一瓶细胞。用于NP1867体外长期治疗的细胞系和培养

CT26细胞系是一种源自BALB/c背景的小鼠未分化结肠癌细胞系。TS/A乳腺癌细胞系建立自BALB/c小鼠中自发产生的中度分化乳腺腺癌。对于长期治疗，其各自细胞培养基中补充了100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素。两种细胞系均在NP1867终浓度0.5 μmol/L或溶剂对照DMSO的持续暴露下培养。每个治疗周期（T）包括4周的持续暴露。CT26细胞在生物学重复三份（"A"、"B"和"C"）中处理最长10个周期（T10），而TS/A细胞在单生物学重复中处理最长六个周期（T6）。在体内使用前，细胞常规进行支原体污染检测和IMPACT I检测（IDEXX Bioresearch）。每个治疗周期结束时，收获活细胞、基因组DNA和细胞沉淀，用于下游分析。

DNA单链断裂（SSB）检测

表达野生型PMS2或PMS2敲除的HAP1细胞以7,500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，静置贴壁。然后，根据需要，将NP1867或NP2567的系列稀释液加入细胞培养基中，或不进行处理。24小时后，向细胞培养基（已含NP1867、NP2567或无处理）中额外加入1 μmol/L 6-TG处理48小时。然后，将细胞从板中洗脱并收集。细胞经福尔马林固定，甲醇透化，并使用APO-direct TUNEL试剂盒（dUTP掺入DNA SSB游离的3'OH末端）对SSB进行染色。使用Attune NxT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）检测dUTP阳性细胞，数据使用相关Attune软件进行分析。

细胞周期检测的增殖指数

细胞接种和处理方式与DNA SSB检测类似，但使用0.8 μmol/L 6-TG。收集前，细胞以10 μmol/L EdU进行45分钟脉冲处理以允许掺入。然后细胞经CytoFix/CytoPerm溶液洗脱、收集、固定和透化。按照制造商说明使用EdU细胞周期试剂盒通过Click-It化学反应进行EdU水平的原位分析。然后收集细胞并在Attune NxT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上分析，相对增殖指数数据在相关Attune软件中分析。

Annexin V Incucyte检测的6-TG耐受性

表达野生型PMS2或PMS2敲除的HAP1细胞以750个细胞/孔的密度接种于384孔板中，静置贴壁4小时。然后，细胞接受或不接受1 μmol/L 6-TG处理，并加入或不加入NP1867、NP2567或溶剂对照。同时加入Annexin V Orange活细胞追踪剂（使用浓度为1:200）。72小时后，使用Incucyte SX5活细胞成像仪（Sartorius）采集图像，并通过Incucyte Cell-by-Cell Analysis Software模块分析以确定相对细胞毒性。

6-TG诱导的MMR修复检测——细胞倍增时间测量

CT26细胞以每孔25,000个细胞的密度接种于12孔板中。细胞立即接受或不接受0.025 μmol/L 6-TG处理，并加入NP1867、NP2567或溶剂对照。72小时后，将细胞脱离，以每孔1,000个细胞的密度接种于黑色多聚-L-赖氨酸包被的96孔板（PDL PhenoPlate，Revvity）中进行高通量成像，设六个技术重复，并重新进行药物处理。同时加入Annexin V Orange活细胞追踪剂（使用浓度为1:200）以监测凋亡细胞。然后立即将板置于Incucyte中，4小时后开始活细胞成像。每孔每4小时采集五个明场图像，持续96小时。各条件的细胞倍增时间使用GraphPad Prism计算，分析最后72小时内汇合率低于80%的变化百分比。Annexin V阳性细胞数量在最后一张图像中测量。

Annexin V Incucyte检测的TMZ耐受性

SW620细胞（10,000个细胞/孔）接种于黑色多聚-L-赖氨酸包被的96孔板（PDL PhenoPlate，Revvity）中进行高通量成像。细胞立即接受或不接受25 μmol/L TMZ处理，有或无NP1867或NP2567。同时加入Annexin V Orange活细胞追踪剂（使用浓度为1:200）以检测凋亡细胞随时间的出现。细胞进行培养并定期成像，剂量-反应研究最多5天，或化合物组合测试时在第4天成像。使用Incucyte SX5活细胞成像仪（Sartorius）采集图像，并通过Incucyte Cell-by-Cell Analysis Software模块分析（见补充视频S1）。

In-Cell Western的6-TG耐受性

CT26和TS/A细胞分别以每孔2,500和4,500个细胞的密度接种于24孔板中。6小时后，细胞贴壁后，向细胞培养基中加入1 μmol/L NP1867或NP2567。细胞接种24小时后，向细胞培养基中加入0.5 μmol/L 6-TG。72小时后（实验开始第4天），将细胞以1:5的比例稀释至新的24孔板中，待细胞贴壁后（6小时）重新给予6-TG处理，有或无NP1867或NP2567。72小时后（实验开始第7天），细胞经PBS洗脱，固定并按制造商说明用CellTag 700 Stain染色。使用Odyssey成像系统（LI-COR Biosciences）测量细胞荧光和强度。

NP1867半胱氨酸组研究用细胞处理

SW620细胞以每个10 cm培养皿4 × 10^6个细胞的密度接种，静置贴壁48小时。次日，细胞用3 μmol/L NP1867或对照溶剂DMSO处理2小时。然后细胞用大量冰冷PBS洗脱，并在1 mL含无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的冰冷PBS中刮取。细胞收集至微量管中，离心沉淀（300 × g，5分钟，4°C）。细胞沉淀速冻并存放于-80°C直至质谱分析（补充方法S1）。

基因组DNA提取

根据需要，细胞经PBS洗脱后沉淀并速冻。使用Relia Prep gDNA Tissue Kit（Promega）按制造商说明提取基因组DNA。

长期治疗基因组改变的分析和测序

小鼠基因组DNA送至IntegraGen SA进行测序。基因组DNA使用Twist Mouse Exome Panel（Twist Bioscience）(48)捕获，进行全外显子组测序（WES）。

Fastq文件使用"BWA-MEM"算法（v.0.7.17）以标准参数比对至小鼠mm10参考基因组，并使用"MarkDuplicates"（Picard v.1.3.0）对重复序列进行注释。如先前报道所述（49），包含超过三个错配且碱基Phred分数<30的reads被排除在分析之外。支持位点呈现链偏倚的reads或reads首尾碱基处发生错配的突变被剔除。突变识别如文献所述进行（50），每个时间点与基线时间点（T0）进行比较，以评估治疗后获得的SNVs。插入缺失（Indel）分析使用Pindel进行，如先前报道所述（50）对获得性突变和生殖系突变进行基因组变异注释。TMB仅从WES数据中评估，基于其整体队列的测序参数，CT26和TS/A分别仅考虑频率丰度大于2.2%和1.7%的核苷酸变异（42）。这些阈值基于变异分析工具的设定，该工具被设定为以至少四个突变reads来识别突变，并且基于所有NGS数据所达到的最低深度（CT26为179X，TS/A为233X）（42）。MSI评分分析

MSI评分使用工具"MSIsensor"（版本0.5；参考文献39）的"msi"功能进行计算，以BALB/c小鼠测序数据作为匹配的对照样本。MSI-H（8）评分阈值取自文献（25）。突变特征分析

CT26突变特征分析如下进行：各时间点重复样本的突变谱使用"SigProfilerMatrixGenerator"（51）v.1.3.0进行评估；对每个时间点，通过对照臂所有重复样本的均值创建共识对照突变特征。然后将此特征纳入突变特征参考COSMIC v3.4（mm10；参考文献52）作为背景特征（DMSO对照），在进行处理臂的突变特征拟合时保留仅由NP1867诱导的突变。使用"MutationalPatterns"（v.3.10.0；参考文献53）R包的"fit_to_signatures"功能进行突变特征拟合分析。TS/A突变特征分析如文献所述进行（46）。从体细胞突变出发，使用工具"SigProfilerMatrixGenerator"（v.3.10.0；参考文献51）创建体细胞突变的突变矩阵，然后使用"MutationalPatterns"（v.3.10.0；参考文献53）R包的"fit_to_signatures"功能进行突变特征拟合分析。突变特征参考COSMIC v3.3（mm10）用于分析中的参考（52）。使用"MutationalPatterns"工具的"cos_sim_matrix"功能评估样本突变谱与拟合突变特征之间的余弦相似度。如先前报道所述（39, 42, 54–56），余弦相似度<0.9的样本被排除在分析之外。动物实验

所有体内实验均按照机构指南以及国家和国际法律和政策执行。动物程序经AIRC分子肿瘤学研究所（IFOM）伦理委员会及意大利卫生部批准，或根据英国内政部1986年《科学程序动物法》（中等严重程度限制）的已批准设施和项目许可证指南执行。实验期间由兽医人员对动物福利进行检查。每天监测小鼠的社会行为、运动功能受损情况和痛苦迹象。当肿瘤体积或肿瘤状况达到许可证限制或小鼠健康状况达到人道终点时，动物被处死。所有研究中，雌性BALB/c和NOD.SCID小鼠（5–8周龄）从Envigo UK或Charles River Laboratories购买。CT26 T10细胞研究

CT26 T10 DMSO细胞和CT26 T10 NP1867 0.5 μmol/L细胞的三个生物学重复样本"A"、"B"和"C"（见"方法"细胞培养-长期处理部分）在体外独立培养。在BALB/c和NOD.SCID小鼠皮下植入肿瘤细胞时，将各细胞系（"A"、"B"和"C"）等量混合，每只动物左侧胁部接种100 μL PBS中的5 × 10^5个总细胞。使用游标卡尺测量肿瘤，并使用椭圆公式计算肿瘤体积V = π/6 × d2 × D（d = 肿瘤短轴；D = 肿瘤长轴；参考文献57）。在测量肿瘤的同时对动物进行称重。BALB/c小鼠在肿瘤细胞植入后第7天随机分组入组，按每组每个细胞条件n = 26分组，此时平均肿瘤体积为83 mm3（DMSO处理组）和54 mm3（NP1867处理组），以腹腔注射方式每两周给予抗PD-1抗体（大鼠IgG2a，κ，克隆RMP1-14）5 mg/kg或同型对照（大鼠IgG2a，κ，克隆2A3），共给予四次剂量。BALB/c卫星动物（每组n = 6）在肿瘤细胞植入后第18天通过随机化工具选取，确保选择能代表各组整体均值。第19天，在第四次抗体给药后24小时，肿瘤被采样、福尔马林固定并石蜡包埋，使用标准自动化方案进行后续NanoString分析。TS/A T6细胞研究

TS/A T6细胞的原位植入通过向每只小鼠右下乳腺脂肪垫注射50 μL Matrigel:PBS（1:1）溶液中的1 × 10^5个细胞进行。使用游标卡尺测量肿瘤，并使用公式V = (d2 × D)/2计算肿瘤体积。在测量肿瘤的同时对动物进行称重。BALB/c小鼠在细胞植入后第5天随机分组入组，当肿瘤可触及时，按每组每个细胞条件n = 10只小鼠分组，以腹腔注射方式每两周给予抗PD-1抗体（大鼠IgG2a，κ，克隆RMP1-14）5 mg/kg或同型对照（大鼠IgG2a，κ），共给予四次剂量。NanoString基因表达谱分析

卫星动物的肿瘤（每组n = 6只小鼠）使用NanoString的nCounter泛癌免疫分析面板进行分析。按照制造商说明并结合NanoString指南，使用RNeasy DSP FFPE试剂盒（Qiagen，#73064）从每个样本的3 × 10 μm FFPE切片中提取RNA。RNA分离后，使用Nanodrop（Thermo Fisher Scientific）和Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）评估样本质量和数量。每份样本使用100 ng RNA与NanoString的PanCancer Immune Profiling Panel CodeSet进行杂交。按照NanoString方案，在65°C下使用CodeSet探针过夜杂交16小时。杂交完成后，将样本装入nCounter Prep Station，按照NanoString标准方案进行卡匣装载。卡匣制备完成后，装载至nCounter Digital Analyzer进行扫描。将生成的RCC文件导入nSolver进行质控评估。基因表达谱数据分析使用nSolver高级分析模块平台进行。统计分析

指示实验数量（图例中的"n ="）的定量数据以均值±SEM表示，另有说明除外。对大多数结果采用双尾分布双样本等方差Student t检验来检验显著性。在需要时，统计检验采用单因素ANOVA后接Tukey检验。对于体内实验，在需要时采用Mann-Whitney非参数检验并使用Holm-?ídák方法进行多重比较校正。数据可用性

本研究生成的数据可在文章及其补充文件中获取。EcMutL:1与人类PMS2:NP1867共结晶结构的蛋白质数据银行坐标和结构因子已分别以登录号9PRP和9S89提交。所讨论的基因表达数据已存入NCBI的GEO数据库，可通过GEO系列登录号GSE326327访问（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE326327）。测序数据已存入EMBL-EBI的欧洲核苷酸档案，登录号为PRJEB110931（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB110931）。质谱蛋白质组学数据已通过PRIDE（58）合作伙伴库存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD077673。作者披露

J. Blagg报告了授予NeoPhore Ltd的专利WO2021148786、授予NeoPhore Ltd的专利WO2023002165和授予NeoPhore Ltd的专利WO2023094834，并且是NeoPhore Ltd的股东和现任员工。P. Riou是NeoPhore Ltd的股东和现任员工。A. Hervieu是NeoPhore Ltd的股东和现任员工。E. Piumatti报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的非财务支持以及与NeoPhore Ltd的科学合作。M.T. Rodriguez-Plata是NeoPhore Ltd的股东和现任员工。P. Battuello报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的非财务支持以及与NeoPhore Ltd的科学合作，并且目前是Merck的员工，该公司未参与本研究。V. Amodio报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的非财务支持以及与NeoPhore Ltd的科学合作。P.P. Vitiello报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的非财务支持以及与Neophore Ltd的科学合作。D.E. Clark报告了授予Neophore Ltd的专利WO2023002165和专利WO2023094834。G.W. Langley报告了"用于确定目标蛋白ATP结合位点的测定和筛选中使用的异吲哚线探针的合成"专利，WO2021148786待定。A. Guarné报告在研究进行期间获得了Neophore Ltd的资助和个人费用。P.C.M. Winship报告了授予Neophore Ltd的待定专利WO2021148786、WO2023002165和WO2023094834。M. Baker报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的个人费用和其他支持。M. Drysdale报告了授予NeoPhore Ltd的专利WO2023002165和专利WO2023094834，并且是NeoPhore Ltd的股东和现任员工。G. Germano报告在研究进行期间获得了NeoPhore Ltd的资助、个人费用、非财务支持和其他支持；此外，G. Germano拥有许可给NeoPhore Ltd的专利PCT/GB2017/051062。A. Bardelli报告在研究进行期间获得了Neophore Ltd的资助、非财务支持和其他支持，以及提交工作之外的Kither Biotech的其他支持；此外，A. Bardelli拥有许可给NeoPhore Ltd的专利PCT/GB2017/051062。其他作者未报告披露信息。作者贡献

J. Blagg：概念化、资源、形式化分析、监督、资金获取、验证、调查、可视化、方法学、撰写—原始草稿、撰写—审阅和编辑。P. Riou：概念化、资源、形式化分析、监督、验证、调查、可视化、方法学、撰写—审阅和编辑。A. Hervieu：概念化、资源、数据管理、形式化分析、监督、验证、调查、可视化、方法学、撰写—审阅和编辑。E. Piumatti：资源、形式化分析、验证、调查、可视化、方法学、撰写—审阅和编辑。M.T. Rodriguez-Plata：概念化、资源、形式化分析、监督、验证、方法学、项目管理、撰写—审阅和编辑。P. Battuello：资源、形式化分析、监督、验证、调查、可视化、方法学、撰写—审阅和编辑。A. Peall：资源、监督、验证、调查、可视化、方法学。V. Amodio：资源、验证、调查、方法学。P.P. Vitiello：资源、调查、可视化、方法学。D.J.H. Nightingale：调查、可视化、方法学。R. Bago：调查、可视化、方法学。P. Tongue：调查。T. Slater：资源、监督、调查。K. Parmar：资源、监督、调查。P. Patel：资源、形式化分析、监督、调查、方法学。J. Rodríguez González：资源、形式化分析、调查、可视化、方法学。D.E. Clark：监督、验证、调查、可视化、方法学、撰写—审阅和编辑。G.W. Langley：形式化分析、监督、验证、调查、方法学、撰写—审阅和编辑。C. Nichols：形式化分析、监督、调查、方法学、撰写—审阅和编辑。A. Guarné：资源、形式化分析、监督、调查、方法学、项目管理、撰写—审阅和编辑。P.C.M. Winship：概念化、资源、监督、资金获取、项目管理、撰写—审阅和编辑。M. Baker：概念化、监督、资金获取、项目管理。M. Drysdale：概念化、资源、监督、资金获取、验证、方法学、项目管理、撰写—审阅和编辑。G. Germano：概念化、资源、监督、资金获取、验证、方法学、项目管理、撰写—审阅和编辑。A. Bardelli：概念化、资源、监督、资金获取、验证、方法学、项目管理、撰写—审阅和编辑。致谢

我们感谢Sasi Arunachalam、Bettina Meier、Giuseppe Rospo、Benoit Rousseau和Lesley Young的有益贡献、专业建议和指导。我们感谢都灵大学及IFOM的Bardelli实验室成员对稿件的批判性阅读。导致这些结果的研究获得了以下资助：欧洲研究委员会（ERC）在欧洲联盟地平线2020研究和创新计划下（TARGET，资助协议号101020342；A. Bardelli）；AIRC 5 per Mille 2028项目—ID. 21091（主要研究者：A. Bardelli）；IMI合同号101007937 PERSIST-SEQ（A.

巴德尔利）；意大利癌症研究基金会（AIRC）IG 2023项目（编号：28922）——项目负责人（A. Bardelli）。P.P. Vitiello获得了意大利癌症研究基金会（AIRC）2024年博士后奖学金支持（编号：31560）。V. Amodio获得了意大利癌症研究基金会（AIRC）2024年博士后奖学金支持（编号：31358）。本文所表达的观点和意见仅代表作者本人，不一定反映欧盟或欧洲研究理事会（ERC）的观点。欧盟和资助机构均不对其承担责任。加拿大光源（CLS）的CMCF-BM光束线是萨斯喀彻温大学的国家研究设施，由加拿大创新基金会、加拿大自然科学和工程研究委员会、加拿大国家研究委员会、加拿大卫生研究学会、萨斯喀彻温省政府和萨斯喀彻温大学共同支持。注：本文的补充数据可在Cancer Discovery在线版（http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/）获取。