miR-150通过mRNA抑制和自噬双重模式调控SOX2控制干细胞命运

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Dual-mode SOX2 regulation by miR-150 via mRNA suppression and autophagy controls stem cell fate

　　

自噬在维持细胞稳态和调控干细胞命运中发挥关键作用。尽管microRNA（miRNA）调节人多能干细胞（hPSCs）中自噬和多能性的作用日益受到重视，但其潜在分子机制仍不完全清楚。本研究明确了miR-150缺陷在hPSCs中偏向外胚层-中胚层谱系特化中的作用，并鉴定SOX2为主要通过改变mRNA稳定性而受调控的关键下游节点，同时涉及自噬相关途径。研究人员通过CRISPR/Cas9介导的miR-150基因座缺失生成了miR-150缺陷型hPSCs。采用一系列分子和细胞技术，研究了miR-150如何调控SOX2和KLHL20表达、调节KLHL20-ULK1相互作用以及影响自噬介导的SOX2降解。使用定向分化方案确定miR-150在胚层谱系特化中的作用。miR-150缺失通过稳定其mRNA导致SOX2表达增加，从而使hPSCs中SOX2蛋白水平升高。同时，miR-150缺陷增加了KLHL20 mRNA稳定性，破坏了ULK1介导的自噬，并抑制了SOX2降解。功能实验表明，miR-150通过KLHL20-ULK1轴双重调控mRNA稳定性和自噬，从而微调SOX2表达，维持中胚层和外胚层谱系的平衡定向。这些发现确立了miR-150作为hPSCs中SOX2活性和自噬的调节因子。通过同时靶向SOX2和KLHL20-ULK1轴，miR-150通过互补机制协调SOX2周转，确保精确的中胚层和外胚层谱系定向。这种多重调控策略为miRNA如何整合细胞内信号通路以指导干细胞命运决定提供了新见解。

干细胞命运决定是发育生物学与再生医学领域的核心问题。人胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）具备自我更新和分化为三胚层的潜能，是研究早期谱系定向的理想模型。转录因子SOX2与OCT4、NANOG共同构成维持多能性的核心转录网络，其表达剂量对谱系选择具有决定性影响：SOX2过表达可促进神经外胚层命运，同时抑制中胚层和内胚层分化。自噬作为一条保守的溶酶体依赖降解途径，在维持细胞稳态与调控干细胞自我更新中发挥关键作用，近期研究还发现自噬可通过多种途径影响SOX2蛋白稳定性。然而，自噬是否直接介导SOX2降解，以及microRNA（miRNA）能否通过连接自噬与SOX2稳态来精确调控早期胚层定向，仍所知甚少。miR-150在多种干细胞和祖细胞系统中被确认是谱系定向的调节因子，但其在人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）由多能性向中胚层-外胚层转变中的功能尚不清楚。针对这一空白，研究人员采用CRISPR/Cas9介导的miR-150基因座敲除策略，在hPSCs中系统研究了miR-150缺失对谱系分化的影响及其分子机制。该研究发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上。其核心发现是：miR-150通过双重模式调控SOX2，一方面直接降低SOX2 mRNA稳定性，另一方面通过抑制KLHL20表达维持ULK1介导的自噬，从而促进SOX2蛋白降解，最终维持中胚层与外胚层谱系的精确平衡。

在关键技术方法上，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了miR-150敲除（miR-150-KO）的H9 hESC系（来源于WiCell）以及先前建立的BMC3 iPSC系，并在HEK293A细胞中进行分子机制验证。主要技术包括RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、免疫荧光、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因检测、RNA稳定性分析（放线菌素D chase）、蛋白质稳定性分析（放线菌酮CHX chase、MG132处理、泛素化检测）、自噬通量检测（CYTO-ID染色、RFP-EGFP-LC3/SOX2串联报告系统），以及覆盖三胚层、神经、造血谱系的定向分化实验和集落形成单位（colony-forming unit, CFU）分析。此外还运用了3D血管类器官模型。

在结果方面，研究共包含六个主要部分。第一，miR-150缺失促进外胚层和神经分化，同时损害中胚层发育和造血细胞形成。三胚层分化实验显示，miR-150-KO细胞中胚层标志物Brachyury和MIXL1表达显著下调，外胚层标志物Nestin和PAX6上调，而内胚层标志物无显著变化；神经分化中PAX6和SOX2升高并产生Tuj1阳性神经元；造血分化中CD34⁺/CD45⁺造血祖细胞和CD34^-/CD45⁺成熟造血细胞均减少，甚至出现异位神经细胞；CFU形成能力亦下降。第二，miR-150缺失增加SOX2 mRNA稳定性，导致SOX2蛋白积累和血细胞分化受损。通过放线菌素D实验证明miR-150缺失减缓SOX2 mRNA降解，荧光素酶报告基因确认miR-150-5p直接靶向SOX2 3'UTR。抑制miR-150-5p可显著上调SOX2，而siSOX2敲低或miR-150 mimic回复可部分恢复造血分化。第三，miR-150调节hPSC自噬。miR-150-KO细胞中SOX2在胞质异常积聚，LAMP1共染提示自噬介导的降解减少；CYTO-ID染色显示自噬活性降低；RFP-EGFP-LC3报告子显示自噬体积累而自噬溶酶体减少，表明自噬通量受阻；Western blot显示ULK1及p-ULK1水平下降，LC3B转化抑制，p62积累。第四，调节自噬可缓解miR-150缺失引起的分化偏向。雷帕霉素（rapamycin, RAPA）激活自噬可恢复ULK1表达并促进SOX2降解，减轻神经分化偏向并改善部分造血分化；而巴弗洛霉素A1和3-甲基腺嘌呤则抑制ULK1并加剧SOX2积聚；ULK1敲低亦增加SOX2，