肉类关联假单胞菌分离株的表型与功能多样性：运动性、生物被膜形成与AI-2活性

《Foods》：Phenotypic and Functional Diversity in Meat-Associated Pseudomonas Isolates: Motility, Biofilm Formation, and AI-2 Activity

　　

假单胞菌属（Pseudomonas）种是有氧冷藏肉类中重要的腐败菌；然而，种间群体感应（quorum sensing, QS）信号自诱导物-2（autoinducer-2, AI-2）在这些细菌中的出现及其与生物被膜形成和运动性的关联仍了解不足。本研究对取自腐败牛排与牛肉糜的假单胞菌分离株进行了生物被膜形成、运动性状及AI-2活性的表征。对预选的产香假单胞菌（Pseudomonas fragi）相关分离株进行RpoD序列分析，揭示出多样的种类组成，其中牛肉假单胞菌（Pseudomonas bubulae）的检出率高于P. fragi，凸显了在该类群中更新分类学方法进行种级鉴定的重要性。35株刚果红琼脂（Congo red agar, CRA） assay阳性分离株在4 °C与25 °C下培养7天评估生物被膜形成。平均生物被膜形成量在25 °C早期孵育显著更高，而延长孵育后在冷藏条件下达到可比水平。采用美人鱼弧菌（Vibrio campbellii）生物发光 assay 在25株分离株中检测到AI-2活性。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示AI-2样活性与生物被膜形成贡献于相似表型维度，而直接Spearman相关分析未揭示两性状间显著单调关系。总体结果表明肉类关联假单胞菌属的表型多面性，并提示生物被膜形成可能受AI-2样活性之外的多种菌株特异与环境因素影响。

研究背景与立项依据

有氧冷藏条件下的鲜肉腐败主要由嗜冷菌尤其是假单胞菌属（Pseudomonas）主导，其中产香假单胞菌（P. fragi）长期被视为代表种。肉类加工环境中生物被膜（biofilm）形成是腐败微生物持留与交叉污染的核心因素；群体感应（QS）通过自诱导物（autoinducer）协调细菌毒力、运动性与生物被膜行为，种间信号自诱导物-2（AI-2）虽在革兰阴性与阳性菌中广泛存在，但在肉类关联假单胞菌中的出现及其与生物被膜、运动性的关系数据匮乏，且传统基于16S rRNA或旧版PCR的鉴定会低估P. fragi复合群（含P. bubulae、P. kulmbachensis等近年新种）的真实多样性。研究人员因此从零售牛肉（牛排与牛肉糜）有氧4 °C贮至感官腐败后分离假单胞菌，整合分类学更新、表型（生物被膜、三种运动性、AI-2）与多变量关联分析，探讨冷藏肉腐败场景下表型架构。论文发表于《Foods》。

主要技术方法概要

研究人员于2022年5月在伊斯坦布尔多地零售市场采集牛排（n=10）与牛肉糜（n=10），有氧4 °C贮至出现异味/变色等腐败迹象后，经Ringer液均质涂布CFC假单胞菌选择性琼脂25 °C 24 h初筛；挑取菌落以P. fragi特异性carA-PCR预筛后，对阳性株扩增rpoD基因测序并借Max Likelihood系统发育与BLAST定种；运动性采用swimming（0.3%琼脂 tryptone）、swarming（0.5%琼脂营养汤+葡萄糖）、twitching（LB 1%琼脂穿刺底触聚苯乙烯皿结晶紫染色）三类平板 assay；生物被膜先以刚果红琼脂（CRA）定性，再对35株CRA阳性株行结晶紫微孔板定量（4 °C与25 °C，1/4/7天，OD590）；AI-2活性以luxN::Tn5Kan美人鱼弧菌（V. campbellii）ATCC BAA-1117报告株检测6 h无细胞上清发光（LCS），以同源BAA-1119为正控、E. coli DH5α为负控；统计用重复测量双因素ANOVA与基于相关矩阵的PCA及Spearman秩相关。

研究结果

3.1 假单胞菌分离株的分子鉴定

162株初分离中93株carA-PCR疑似P. fragi相关；rpoD测序归并后57株为P. bubulae（近年在牛肉描述的新种）、15株P. fragi，其余散归P. kulmbachensis、P. psychrophila、P. deceptionensis、P. paraversuta、P. taetrolens、P. lundensis、P. weihenstephanensis、P. saxonica等，另8株成近P. bubulae/P. kulmbachensis的独立分支（rpoD相似度96–98%，低于确认种>99%），提示未表征谱系。结果显示P. bubulae在牛排与牛肉糜均为主优势，证明P. fragi复合群在肉类生境比既往认知更多样，旧PCR引物因早于新种描述而漏检。

3.2 分离株的运动表型

81株分析株中swimming 77株阳性（95.1%，径6–35 mm）、twitching 78株（96.3%，径7–81 mm）、swarming 42株（51.9%，径4–25 mm）；株YB43具最大twitching（81 mm）与swarming（25 mm）。肉类株swimming/twitching频率显著高于文献中乳源假单胞菌，运动直径异质性大，受琼脂浓度与培养基影响需谨慎横比。

3.3 生物被膜形成能力

CRA定性35/81株阳性（产黑/暗红菌落），微孔板定量显示多数株与参考株P. aeruginosa ATCC 27853、P. fragi ATCC 4973^T在25 °C生物量高于4 °C，但数株冷藏下持平或更高。重复测量ANOVA：温度主效显著（F=4.199, p=0.048），时间主效显著（F=11.660, p<0.001），温×时交互不显著（p=0.112）；描述上4 °C下1→4天升、7天维持，25 °C下1→4天升、7天回落。表明部分肉源假单胞菌在冷藏可维持甚至延滞蓄积生物被膜，利于加工环境持留。

3.4 自诱导物-2（AI-2）活性

81株中25株诱导报告株发光，高活性株含YK101/YK90/YK24/YK56/YB79，部分株（YB4/YK115等）媲美正控，P. fragi模式株活性偏低。研究者比对代表性种基因组未获可辨luxS同源，提示所测AI-2样活性未必源于经典LuxS途径，可能经戊糖磷酸途径中间体非酶促生成或外源感知（如P. aeruginosa借PctA/TlpQ趋化受体应答）；故“AI-2活性”应作表型读数而非保守QS通路证据。

3.5 运动性、生物被膜与AI-2活性的关联

对81株标准化变量行PCA，PC1（37.03%）载荷向twitching/swarming等运动性，PC2（25.10%）载荷向AI-2与生物被膜同侧，两维共释62.12%方差；得分图无紧密簇，YK107因高生物被膜沿PC2远分，YB43因强运动沿PC1远分，YB93高生物被膜但AI-2阴性亦落PC2。对35株定量生物被膜亚群行Spearman秩相关，AI-2与OD590无单调显著相关（ρ=0.057, p=0.744）。即PCA同维共载仅示探索性多维倾向，非两性状直接因果/线性绑定；生物被膜由株系特异调控与环境因子共决。

讨论与结论翻译

讨论指出，AI-2介导QS在番茄、菠菜、发酵食品等生态中有促生物被膜报道，但肉源假单胞菌中本研究与Ferrocino等少数工作外仍稀缺；且Pseudomonas多数缺luxS，AI-2样信号可为感知性或代谢旁路产物。PCA共载与Spearman零相关并存说明单变量分析会掩盖多维表型结构，株间变异大令AI-2不足以解释生物被膜。从食品安全外延看，高生物被膜假单胞菌可在双种生物被膜中助单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、肠炎沙门菌（Salmonella enteritidis）冷藏持留，故表型框架具间接安全意义。结论部分译文：综上，本研究揭示肉源假单胞菌分离株表型多样性显著；P. fragi相关株中P. bubulae占优，凸显更新分类学界定种名价值；生物被膜受温度调节，早期冷藏偏低但部分株冷藏可持留；子集株具AI-2活性，多变量中AI-2与生物被膜共居一维而运动性近独立维，但直接相关不显著，表明生物被膜受多重调控与生理因子影响。结果为理解肉源假单胞菌多样性提供表型框架，部分株强生物被膜与AI-2样活性在多物种生物被膜与病原体持留场景具延伸研究价值。