精油对莴苣叶片表面大肠杆菌的抗生物膜活性

《Foods》：Antibiofilm Activity of Essential Oils Against Escherichia coli on Lettuce Leaf Surfaces

　　

背景：新鲜叶菜因其高营养价值而被广泛食用，但也被认为是食源性病原体的重要载体。大肠杆菌（Escherichia coli）易于附着于莴苣表面并形成生物膜，从而增强细菌的持久性并降低常规清洗程序的有效性。本研究评估了莳萝、罗勒、冬季香薄荷和薄荷精油（essential oils, EOs）在细菌初始附着阶段以及针对polystyrene表面和莴苣叶片上预形成生物膜的抗生物膜活性。方法：采用刚果红琼脂、结晶紫微板法和莴苣叶片细菌附着试验评估生物膜形成，同时通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察生物膜结构及精油处理效果。通过肉汤微量稀释法测定抗菌活性，并分别在0.5 × MIC、MIC和2 × MIC浓度下，利用结晶紫法和莴苣叶片附着试验评估对初始细菌附着和预形成生物膜的抗生物膜活性。结果：所检测的大肠杆菌分离株主要呈现rdar形态型，且在25 °C条件下形成的生物膜强于37 °C。所有受试精油均以浓度依赖性方式显著减少初始细菌附着并破坏预形成的生物膜。莳萝精油表现出最强的抗菌和抗生物膜效果，其次为罗勒、冬季香薄荷和薄荷精油。在2 × MIC浓度下，受试精油使初始细菌附着减少74.17%–84.63%，而莳萝精油在60分钟后使polystyrene表面预形成的生物膜减少59.90%。SEM分析证实，精油处理后生物膜结构遭到广泛破坏，细菌细胞出现明显的形态损伤。结论：这些研究结果表明，精油特别是莳萝精油能有效抑制大肠杆菌生物膜在polystyrene和莴苣叶片上的建立与持久性，突显了其作为天然抗生物膜剂以改善新鲜农产品微生物安全性的潜力。

研究背景

新鲜即食叶菜因其高营养价值而广泛消费，但同时也被认为是食源性病原菌的重要传播载体。大肠杆菌（Escherichia coli）可附着于莴苣表面并形成生物膜，增强细菌在植物表面的持久性，从而降低常规清洗和消毒程序的有效性。流行病学监测显示，2014—2021年间与叶菜相关的食源性暴发有78起，其中莴苣频繁被确认为传播媒介。目前常用的非热杀菌技术如常规清洗、高静水压、脉冲电场、超声波和化学消毒剂等，对生物膜内嵌病原菌的清除效果有限，且存在成本高、消费者接受度低和残留副产物等问题；热力处理则因损害叶菜的质地、色泽和营养品质而不适用。精油（essential oils, EOs）因其广谱抗菌活性和公认安全（Generally Recognized As Safe, GRAS）地位而受到关注，但其对新鲜农产品表面大肠杆菌生物膜的控制效果，特别是对莴苣叶片这一复杂食品基质上生物膜的作用尚缺乏系统研究。因此，本研究旨在评估四种精油对莴苣叶片表面大肠杆菌的抗生物膜活性，并探索其作为天然净化剂的应用潜力。

研究内容概述

研究人员以塞尔维亚诺维萨德科学兽医研究所（Scientific Veterinary Institute of Novi Sad, Serbia）提供的24株动物源性食品分离大肠杆菌为研究对象，经刚果红琼脂菌落形态型鉴定和结晶紫微板法筛选，选出产膜能力最强的菌株作为代表菌株用于后续实验。精油经水蒸气蒸馏提取，采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）鉴定化学成分。通过肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），随后在0.5 × MIC、MIC和2 × MIC浓度下，分别利用结晶紫法评估精油对初始附着和预形成生物膜的影响，并定义了最小生物膜抑制浓度（MBIC₅₀）和最小生物膜根除浓度（MBEC₅₀）。同时采用莴苣叶片贴片结合低频超声脱附菌落计数法评估精油在叶片表面的抗生物膜效果，并利用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜超微结构变化。统计分析采用线性混合效应模型方差分析和Tukey事后多重比较。

主要研究结果

3.1. 生物膜产生

3.1.1. 菌落形态鉴定

在刚果红LB无NaCl琼脂上经96小时培养后，分离株呈现rdar、bdar、ras和saw四种形态型。25 °C下rdar形态型占优势（10株），其次为saw（7株）、bdar（4株）和ras（3株）；37 °C下分布类似。rdar形态型总体占优（25 °C为42%，37 °C为38%），反映出菌群具有较高的生物膜基质产生能力。同时观察到rdar与bdar之间存在温度依赖性转变，证明温度信号可特异性调控胞外基质组成。

3.1.2. 结晶紫法分析

所有分离株在两种温度下均能形成生物膜，但形成量差异显著。25 °C下强产膜菌占12.5%，37 °C下降至8.3%；中等产膜菌比例从41.7%降至25.0%，而非产膜菌比例从20.8%升至41.7%。方差分析显示温度对生物膜形成有显著影响。从中筛选出生物膜产量最高的菌株用于精油试验。

3.1.3. 莴苣叶片表面附着

在25 °C和37 °C条件下附着量分别为6.64 log CFU/cm²和6.01 log CFU/cm²，温度升高使附着量下降约10%。表明低温更有利于细菌在植物表面的定殖。

3.1.4. 扫描电子显微镜观察

SEM显微照片显示，25 °C下形成的微菌落周围胞外基质数量明显多于37 °C，表明温度影响生物膜的结构组织和成熟程度。

3.2. 精油化学成分及抗菌活性

莳萝精油主要成分为香芹酮（carvone，66.6%）和柠檬烯（limonene，25.3%）；薄荷精油主要含薄荷醇（menthol，30.8%）和薄荷酮（menthone，28.8%）；罗勒精油以芳樟醇（linalool）为主；冬季香薄荷富含p-伞花烃（p-cymene，33.8%）、香芹酚（carvacrol，32.9%）和γ-松油烯（γ-terpinene，15.9%）。抗菌活性测定显示，莳萝精油效果最强，MIC和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）均为3.55 μL/mL；罗勒和冬季香薄荷的MIC为7.10 μL/mL；薄荷精油活性最低，MIC为14.20 μL/mL。

3.3. 精油对初始附着和预形成生物膜的影响

3.3.1. 对初始附着的影响

四种精油均呈剂量依赖性抑制初始附着，0.5 × MIC时减少46.48%–64.23%，MIC时减少67.87%–78.39%，2 × MIC时减少74.17%–84.63%，效果顺序为莳萝 > 罗勒 > 冬季香薄荷 > 薄荷。即使在亚抑制浓度下，精油也能显著削弱细菌早期定殖能力。

3.3.2. 对预形成生物膜的体外作用

精油对预形成生物膜的清除呈浓度和时间双重依赖性。2 × MIC处理60分钟时，莳萝精油使生物膜减少59.90%，罗勒精油减少50.86%，二者达到MBEC₅₀标准；而冬季香薄荷和薄荷精油在所有条件下均未达此阈值。0.5 × MIC、15分钟时各精油减少率仅4.33%–10.30%，表明成熟生物膜的耐受性显著增强。

3.3.3. 对莴苣叶片预形成生物膜的活性

精油处理显著降低莴苣叶片表面生物膜相关活菌数。2 × MIC下，莳萝、罗勒、冬季香薄荷和薄荷精油的减少率分别为40.0%、34.5%、33.4%和26.0%。与polystyrene表面相比，莴苣叶片上的效果普遍偏低，表明食品基质的复杂性会影响精油的抗菌效力。

3.3.4. 精油暴露后莴苣叶片表面生物膜的SEM观察

经莳萝精油处理后，SEM显示生物膜结构碎裂，微菌落减少，细菌细胞明显变形并出现胞内物质泄漏，细胞表面粗糙不规则，证实精油通过破坏细胞膜完整性发挥抗生物膜作用。

3.4. 结果统计分析

三因素方差分析表明精油种类、浓度和暴露时间对抑菌效果均有极显著影响，其中浓度为主导因素，且存在显著的三因素交互作用，说明抗生物膜活性是多种因素协同作用的结果。

讨论与结论

研究证实，大肠杆菌在新鲜叶菜上的持久性与生物膜形成密切相关，且生物膜形成是受环境温度调控的适应性过程。25 °C环境有利于rdar形态型表达和胞外基质产生，从而促进细菌在莴苣表面的附着和生物膜成熟。精油可有效抑制初始附着并破坏已形成的生物膜，其中莳萝精油因其高香芹酮含量而效果最优。但精油对莴苣表面的效果低于polystyrene，这可能与莴苣表面蜡质层对亲脂性精油成分的吸附有关。SEM结果支持膜破坏是精油抗生物膜活性的主要机制。研究结论指出，精油特别是莳萝精油可作为天然抗生物膜剂，在防止早期细菌附着和生物膜建立方面具有较大的实际应用价值，但其更适用于预防性早期干预而非成熟生物膜的彻底清除。未来需在实际加工条件下优化应用方式、评估感官影响并验证其与现有非热杀菌技术的协同效果。